مطالب از سایت رویان است
www.royan .cjb.com

کشت بافت و کاربرد آن در داودی

1- تکثیر از طریق کشت بافت

1-1- محیط کشت و ریزنمونه

برای تهیه ریز نمونه در داودی از برگهای جوان نیمه باز با رنگ سبز روشن به طول 5-2 سانتی متر استفاده شده است. ضد عفونی کردن برگهای رشد یافته در شرایط گلخانه با هیپوکلریت سدیم 5% حجمی/ حجمی به مدت 5 تا 10 دقیقه و ضد عفونی کردن برگهای گیاهان رشد کرده در شرایط مزرعه با هیپوکلریت سدیم 10% حجمی/ حجمی انجام گردید.
ریز نمونه هایی به اندازه 2/1-1 سانتی متر مربع از قطعات برگی یا تک گره تهیه می شوند. محیط کشت پایه استفاده شده شامل MS پایه (Murashige and Skoog, 1962) با نمکهای پایه به اضافه 30 گرم در لیتر ساکارز، 1 گرم در لیتر میوانیوسیتول، 5 میلی گرم در لیتر تیامین HCl و همراه با 8 گرم در لیتر آگار و 7/5=pHمی باشد محیط کشت استریل شده در پتری های 15 * 60
میلی متری توزیع می شود. تنظیم کننده های رشد با توجه به هدف آزمایش تهیه و در محیط کشت اضافه می شود.
باززایی شاخساره های نابجا از کالوس های حاصل از ریز نمونه های برگ و ساقه دو رقم تجاری داودی به نامهای Chrysanthemum morifolium cv. Brietner (بنفش چوب بستی) و Chrysanthemum morifolium cv. Marion (کرم) در دو نوع محیط رشد مورد مطالعه قرار گرفت. محیط رشد باززایی هر دو رقم، محیط پایه MS به همراه هورمون NAA (1/0 تا 25/0 میلی گرم در لیتر) و BA (2 میلی گرم در لیتر) در نظر گرفته شد. نتایج نشان داد در بیشتر موارد درصد باززایی ریز نمونه ساقه نسبت به برگ (در هر دو رقم) بیشتر بوده است. رشد و ریشه دهی گیاهچه های حاصل از باززایی هر دو رقم بطور همزمان در محیط MS انجام گرفت. بیشترین میزان تولید کالوس از ریزنمونه های برگ به طول 5/1 – 2 سانتیمتر روی محیط MS حاوی 5 میلی گرم BAP و 5/0 میلی گرم در لیتر کینتین بدست آمد. در محیط MS حاوی 2/0 میلی گرم در لیتر IBA ریشه زایی به میزان 100% صورت گرفت.
باززایی شاخساره از قطعات گره (Nodal segment) و نوک شاخساره (Shoot tip ) به ترتیب در محیط MS حاوی 0/1 میلی گرم در لیترBAP و ریشه زایی در محیط MS حاوی 2/0 میلیگرم در لیتر IBA به میزان 95% و 91% موفقیت آمیز بوده است.
از نوک شاخساره و قطعات تک جوانه نیز برای تکثیر سریع داودی استفاده شده است. بیشترین میزان تکثیر در محیط MS حاوی 30 گرم در لیتر ساکارز و 0/1 میلی گرم در لیتر BAP، 2/0 میلیگرم در لیتر NAA و 10 میلی گرم در لیتر اسید جیبرلیک حاصل شده است. ریشه زایی در زمان کوتاهی ( حدود 5 روز) روی محیط MS حاوی 0/1 میلیگرم در لیتر IAA صورت می گیرد.
همچنینازدیاد داودی از طریق کشت مریستم انتهایی نیز بر روی محیط MS حاوی Kin (2-0 میلی گرم در لیتر)، NAA (2-0 میلی گرم در لیتر) به تنهایی یا در ترکیب با یکدیگر مورد بررسی قرار گرفت و نتایج این بررسی نشان داد که بیشترین وزن تر کالوس (2096 میلی گرم در هر لوله آزمایش) در غلظت 1 میلی گرم در لیتر NAA به همراه 5/0 میلی گرم در لیتر Kin حاصل می شود، در حالی که در کشتهای فاقد هورمون وزن تر کالوس 20 میلی گرم ارزیابی گردید. اگر چه تمایز ریشه و شاخساره در محیطهای حاوی NAA و یا Kin وجود دارد. ولی با این حال در محیطهای حاوی هورمون NAA تمایز ریشه و در محیطهای حاوی Kin سرعت رشد شاخساره بهترمی باشد. آزمایشات نشان داده که ریز نمونه های ساقه و برگ داودی نسبت به هورمون NAA در مقایسه با هورمون BAP حساسیت و واکنش بیشتری نشان می دهند. بالاترین درصد باززایی شاخساره از گلچه های داودی، در ترکیب هورمونی NAA با BAP و IAA با BAP گزارش شده است. در این بررسی ترکیب هورمونی IAA با Kin، تاثیر معنی داری در باززایی شاخساره نداشته است.

1-2- مرحلة فیزیولوژیکی گیاه و زمان کشت

ریزنمونه های جوان ساقه داودی (تهیه شده از گیاه 9 هفته ای) در مقایسه با ریز نمونه های مسن تر (تهیه شده از گیاه 19 هفته ای) تولید شاخساره بیشتری در محیط کشت نشان میدهند. علاوه بر این باززایی شاخساره ریزنمونه های تهیه شده در فصل زمستان در مقایسه با بهار و تابستان بیشتر می باشد.
برای بررسی زمان کشت، مریستم انتهایی داودی بطور ماهیانه، در فاصله بین مهر تا اردیبهشت در شرایط آزمایشگاهی مورد کشت قرار گرفت و مشاهده شد که استقرار ریز نمونه های تهیه شده بعد از مهر ماه کاهش نشان می دهد بطوریکه در دی ماه به کمترین میزان خود می رسد. استقرار ریز نمونه های تهیه شده در فاصله بین فروردین تا اردیبهشت عموماً‌ 100 درصد می باشد. همچنین در سرعت رشد ریز نمونه های تهیه شده در فصل بهار یک افزایش تدریجی مشاهده می شود. باززایی آن دسته از ریز نمونه های انتهایی ساقه داودی که در فاصله بین فروردین تا اردیبهشت ماه تهیه و کشت شده بودند، فاقد مرحله کالزایی نشان داده شد، در حالی که ریز نمونه های تهیه شده در زمانهای دیگر، اغلب مرحله کالزایی نیز نشان می دادند.

1-3- اثر نور و دما

در مورد کشت بافت داودی، همواره استفاده از نور لامپ فلورسنت سفید در یک تیمار نوری 16 ساعت روشنایی به همراه 8 ساعت تاریکی توصیه شده اشت. البته در بعضی موارد گزارشاتی مبنی بر استفاده از 15 ساعت روشنایی به همراه 9 ساعت تاریکی نیز وجود دارد. شدت نور مورد استفاده نیز بین 3000 تا 4000 لوکس گزارش شده است.
در اغلب گزارشات، دمای مورد نیاز برای رشد و نمو ریزنمونه ها ی در داودی، 22 تا 26 درجه سانتیگراد ذکر شده است.

2- کشت مریستم و تولید گیاه عاری از ویروس
اعمال تیمار گرمایی 38-35 درجه سانتیگراد بر روی گیاهان داودی در شرایط گلخانه ای به مدت 4 الی 37 هفته و سپس کشت مریستم منجر به تولید داودی های عاری از ویروسهای virusB, vein mottle, greenflower aspermy, stunt شده است. مقایسه تولید گیاهچه های عاری از بیماری از ریزنمونه های مریستم در دو حالت پیش تیمار گرمایی (37 درجة سانتیگراد به مدت 8 هفته) و بدون پیش تیمار گرمایی از جوانه های جانبی
(lateral shoot) با طول 4/0- 5/0 میلی متر و روی محیط MS تغییر یافته صورت گرفت و مشاهده شد که مریستم های حاصل از تیمار گرمایی رشد سریعتر و بقاء بهتری نشان می دهند. 93% از مریستم هایی که تیمار گرمایی دیده بودند شروع به پر آوری کردند در حالی که این میزان در مریستم های تیمار نشده 6/83% بود. همچنین ریشه زایی در شاخساره های حاصل از گیاهان تیمار شده خیلی زودتر شروع گردید. گیاهچه های ریشه دار شده به گلدانهای حاوی پیت موس و پرلایت منتقل شدند.

3- جنین زایی سوماتیکی
تولید جنین های سوماتیکی داودی در ریزنمونه های برگ 12 رقم از مجموع 23 رقم مورد بررسی روی محیط MS حاوی 2,4-D و BA مشاهده گردید اما فقط باززایی 5 رقم موفقیت آمیز بود.
همچنین جنین زایی سوماتیکی از ریزنمونه های گلبرگهای شعاعی Dendranthema grandiflorum kitamura روی محیط MS حاوی غلظتهای بالای IAA و Kinetin صورت گرفت. در این آزمایش استفاده از NAA منجر به جنین زایی گردید اما استفاده ازIBA و 2,4-D بر روی جنین زایی تاثیری نداشت. سیتوکنین های BAP و Thidiazuron نیز در ایجاد جنین زایی مؤثر نبودند. همچنین در غلظتهای پایین IAAهمراه با Kinetin و غلظتهای مختلف BAP جنین زایی صورت نگرفت. البته در غلظتهای بالای BAP تعداد زیادی شاخساره نابجا تولید گردید. در ریزنمونة برگ، هیچ کدام از ترکیبات تنظیم کننده های رشد مورد استفاده، منجر به جنین زایی نگردید.
جنین زایی سوماتیکی ریز نمونه های برگ داودی تحت تاثیر دو فاکتور نور و ساکارز، بر روی محیط اصلاح شده موراشیگ و اسکوگ (MSB) حاوی 1 میلی گرم بر لیتر 2,4-D به همراه 2/0 میلی گرم بر لیتر BA، مورد مطالعه قرار گرفت و مشاهده شد ریز نمونه هایی که بر روی محیط حاوی 9 تا 18 درصد ساکارز، در شرایط 28 روز تاریکی در ابتدا و به دنبال آن 10 روز روشنایی و برگشت دوباره آن به 14 روز تاریکی قرار می گیرند جنین زایی نشان می دهند. بیشترین میزان جنین زایی، در غلظتهای 12 تا 15 درصد ساکارز مشاهده می شود و غلظتهای کمتر ساکارز عمدتاً بر روی نمو ریشه و شاخساره ها موثر می باشند.

---------------------------------------

پایلوت کشت بافت گیاهان گرمسیرى و زینتى از طریق کشت بافت



کشت سلول و بافت گیاهى که با عنوانهاى کشت این ویترو و یا کشت استریل نیز مطرح مى شود، ابزارى مهم در مطالعات پایه و کاربردهاى تجارى است. در حال حاضر به عملیاتى نظیر کشت سلولها، بافت ها و اندام هاى استریل و اجزاى آنها تحت شرایط مطلوب فیزیکى و شیمیایى در آزمایشگاه، "کشت بافت گیاهى" اطلاق مى شود.

استفاده از فن آورى کشت بافت براى تکثیر رویشى گیاهان یا ریزازدیادى مهمترین کاربرد تجارى این فناورى است. با این فن آورى مى توان از یک گیاه میلیونها گیاه جدید، با کیفیت خوب و در زمان کوتاه تولید کرد. کشت بافت سلولى با ارائه تئورى سلولى در قرن 19 آغاز گردید. این تئورى عنوان مى کند که سلول واحد ساختمانى مستقل و عملى یک موجود است. کاربرد تجارى کشت بافت در سال 1960 در آمریکا با ریزازدیادى ارکیده آغاز شد.

به طور کلى امتیازهاى روش ریزازدیادى را مى توان در موارد زیر خلاصه کرد:

- گیاهان تکثیر شده به روش کشت بافت از قدرت رشد بالایى نسبت به گیاهانى که به روش هاى سنتى تکثیر مى شوند برخوردارند.

- ازدیاد آن گروه از گیاهانى که با روش هاى سنتى به سختى تکثیر شده و یا از نظر اقتصادى مقرون به صرفه نیستند.

- تکثیر و تولید تعداد زیادى از کلون هاى با ژنتیک معین.

- بذور از ریسک کمترى براى جوانه زدن برخوردارند.

- آزاد شدن از قیود اقلیمى موجود از نظر فصل و زیستگاه و در تمام طول سال مى توان گیاه تولید کرد.

- حمل و نقل مواد گیاهى را راحت تر مى کند.

- نگهدارى دراز مدت و میان مواد گیاهی.

- تکنیک هاى کشت بافت در تولید گیاهان عارى از ویروس، دستکارى ژنتیکى، هیبریداسیون سوماتیکى، اصلاح نباتات و مطالعات پایه استفاده مى شوند.

براى برقرارى ارتباط بین تحقیق و عملیات کاربردى، مرکز پژوهشهاى بیوتکنولوژى خلیج فارس پایلوت کشت بافت گیاهى را براى تکثیر انبوه برخى از گونه هاى باغبانى و عرضه به بازار راه اندازى کرد. از گونه هاى باغبانى که تا کنون در این مرکز تولید شده اند مى توان به محصولات میوه اى مانند موز و انگور و گیاهان زینتى مانند فیکوس بنجامین، اسپاتیفیلیوم، ارکیده، بنفشه آفریقایى، رز، هاورتیا و غیره اشاره کرد. این گیاهان جوان در گلدانهاى کوچک مناسب براى نهالستانهایى هستند که تا زمان رسیدن به اندازه استاندارد قابل فروش پرورش یابند.







رگانا یک محصول جدید از این پایلوت مى باشد. این گیاه زینتى در لوله شیشه اى است که همه مواد لازم براى رشد گیاه در ژل غذائى داخل لوله وجود دارد و نیازى به دادن آب ، غذا و هوا به آن نمیباشد.







----------------------------------

آموزش عملی کشت بافت

مقدمه ( گیلاس )

اقلام مورد نیاز برای کشت بافت خانگی

آمایش واسطه ای

ضد عفونی ادوات و دیگر اقلام

ضد عفونی مواد گیاهی

عملیاتی در جعبه های سترون





مقدمه



تکثیر ذره ای، جایگزین مهمی برای شیوه های مرسوم تکثیر گیاه می باشد.

این تکثیر، فرآوری گیاهان را از بخش های خیلی کوچک گیاه، در بر می گیرد ( برای مثال : جوانه ها، گره ها، قطعات برگ، قطعات ریشه، و غیره ) که بطور ضد عفونی شده ( عاری از هر گونه میکروارگانیسم ) در ظرف کشت، در جایی که محیط و مواد غذایی می توانند کنترل شوند، رشد می کنند. گیاهان حاصله، از نظر ژنتیکی، همانند گیاهان والدین می باشند.

در حالی که در آزمایشگاه تحقیقاتی، همچون آنها در کشاورزی، و علم خاک در UNE، ما تجهیزاتی با فناوری خیلی پیشرفته را به کار می بریم تا به فرآوری گیاه، از طریق کشت بافت دست یابیم. این مهم است که در نظر بگیریم که باغبانان زیادی، و علاقمندان به این کار، می توانند ادوات و تجهیزات با فناوری پیشرفته را با القام معمولی خانگی جایگزین کنند.



اقلام مورد نیاز برای کشت بافت خانگی



1. یک جعبه ی سترون با هوای راکد، جهت انتقال گیاهان به کار می رود. یک حوض ماهی در یکسوی آن، جعبه ی انتقالی ایده آلی را بوجود می آورد. هر پلاستیک یا محفظه ی شیشه ای، با اندازه های 50 سانتیمتر ( طول )، 40 سانتیمتر ( ارتفاع )، و 40 سانتیمتر ( عمق )، به راحتی می تواند داخل جعبه ی انتقالی ایجاد شوند.

2. دیگ زودپزی برای ضدعفونی کردن واسطه ها، ادوات، آب، دستمال کاغذی و غیره.

3. قالب های شیشه ای ( قالب های غذای کودک عالی می باشند ) و ظروف خوراکی دور ریخته، با سرپوش هایی که نسبت به گرما، درون دیگ های زودپز مقاوم می باشند، ظروف ایده آلی جهت استفاده می باشند.

4. اسکالپل و پنس

5. دستمال کاغذی یا حتی کاغذ نسخه ی سفید A4 ، با اندازه های تقلیل یافته، می توانند ضد عفونی ( سترون ) شوند، و برای سطح برش سترونی مورد استفاده قرار گیرند.

6. یک چراغ الکلی دارای الکل اتیلیک(اتانول)، جهت شعله ور کردن ادوات ( از به کارگیری الکل متیلیک (متانول)، بپرهیزید زیرا که آن سمی می باشد ).

7. شیشه ی (بطری) افشانک دستی، شامل 70% محلول الکل می باشد تا سوختگاه ( محفظه ) انتقال، و سطوح دیگری می باشد تا اسپری پاشی کنند.

8. محلول کلر رقیق، 4/1 رقت سفید کننده های خانگی، ( برای مثال: White King)، برای استفاده در سطوح سترون مواد گیاهی.

9. هر نوع ضد عفونی کننده ی پوست، برای مثال : Hibitane ( قابل حصول از هر داروخانه ای ).

10. واسطه ها ( به قسمت زیرین نگاه کنید ).





آمایش واسطه ها



همه ی عناصری که در زیر ارائه شده اند، می توانند از سوپرمارکت ها، داروخانه ها و فروشگاههای لوازم بهداشتی، خریداری شوند.

1. دو فنجان آب باران

2. یک چهارم فنجان شکر

3. مایه ی کود شیمیایی: 2/1 قاشق سوپخوری همه منظوره 10:10:10( N.P.K.) کود شیمیایی قابل حل در آب در 1 لیتر از آب: یک فنجان از مایه را برای این دستورالعمل به کار برید.

4. قرص انوزیتول ( 500 mg ) : 2/1 قرص

5. قرص ویتامین با تیامین : 2/1 قرص – هر نوع قرص مولتی ویتامینی می تواند استفاده شود.

6. پولک های ( فلس ها ) آگار : 4 قاشق سوپخوری

این واسطه ی بنیادی ( اساسی ) می باشد. برای آمایش تکثیر و ریشه دهی ( شیار زنی )

واسطه، 2/1 فنجان شیر نارگیل و 2/1 قاشق سوپخوری مالت می افزاید.

شیر نارگیل را با 2/1 فنجان پوره ی گوجه فرنگی سبز یا 2/1 فنجان آب میوه ی تر و تازه جایگزین کنید

آب پرتقال می تواند واکنش های متفاوتی را ایجاد کند. از این اطمینان حاصل کنید که pH محیط کشت همیشه بین 5 و 6 باشد، تا pH با میزان محدودی را که شاخص اندازه ی pH با میزان وزن خالص باشد را اگر لازم باشد با اسید، برای مثال : اسید سیتریک یا باز، برای مثال : بی کربنات سدیم، به کار برد.

عناصر را در روغن دان ( ماهیتابه ) ترکیب کنید، و به آرامی بجوشانید تا زمانی که آگار حل شده باشد؛ مرتباً آنها را به هم بزنید تا از چسبیدن آگار جلوگیری به عمل آورید و متعاقباً زیر ماهیتابه را به اشتعال در آورید. برای پخش کردن آنها داخل قالب های شیشه ای، از یک ملاقه ( چمچه ) استفاده کنید تا اینکه محیط کشت حدود 2 سانتیمتر عمق پیدا کند.

در یک دیگ زودپزی اختفا کنید و پرورش دهید. به مدت 15 دقیقه پس از اینکه فشاری حاصل شد، بپزید. ( این زمانی حاصل خواهد شد که دریچه ی فشار اجازه ی بیرون آمدن بخار را می دهد ).



ضد عفونی کردن ادوات و اقلام دیگر



پنس و اسکالپل می توانند با شستشو در محلول کلر یا با فرو بردن در الکل یا شعله، ضد عفونی شوند.

آب سترون ( ضد عفونی شده ) برای آبکشی مواد گیاهی و دستمال کاغذی سترون به عنوان یک سطح پاکی که بشود روی آن کار کرد، مورد نیاز می باشند.

کار هایی که با دست انجام می شوند، می توانند روی کاغذ انجام شوند. زمانی که عملیات تمام شد، دستمال کاغی را می شود به دور انداخت، و یک سطح سترون تازه ای را از فرآورده های سفرون بر می گزبنیم. آب را می توان در قالب های شیشه ای سترون کرد. کاغذ ها را در کیسه های کاغذی قرار دهید و آنها را در دیگ زود پز، روی سطوح آبی بپزید.

کیسه، در اتمام عملیات ضد عفونی، مرطوب خواهد شد.

کیسه را به یک دستگاه گرماسازی در 80 درجه ی سانتیگراد منتقل کنید، و به کیسه این امکان را بدهید که داخل کوره خشک شود. کاغذ ها را تا زمانی که مورد نیاز نباشد، باز نکنید.





ضد عفونی کردن مواد ( اجسام ) گیاهی



همه ی مواد گیاهی می توانند در سفید کننده های رقیق خانگی ضد عفونی شوند، برای مثال : White King ( 4/1 فنجان White King + 4/3 فنجان آب + یک قطره پاک کننده – پاک کننده ای که همچون سورفاکتانت عمل کند ). تکه های گیاهی را در قالب هایی که سفید کننده ها را به مدت 12-10 دقیقه در بر دارند. بارها آنها را به هم بزنید. محلول کلر را به دور بریزید، این عمل باکتری و قارچ و گاهی اوقات برخی اجزای گیاه همچون پولکهای بیرونی و پاجوش های نرم را از بین خواهد برد.

تکه های گیاهی را دو مرتبه با آب سترون شستشو دهید.



عملیاتی در جعبه های سترون



محافظت بیشتری باید انجام شود تا اطمینان حاصل کنید که کشت شما عاری از هر گونه آلودگی ( ناخالصی ) می باشد. برای دست یابی به این، شرح ذیل را انجام دهید :

1. موهای خودتان را به پشت سرتان گره بزنید، آستین های خود را بالا بزنید و ساعت و هر چیز ارزشمند دیگر را بردارید. ( باز کنید ). دستهای خود را کاملاً با محلول ضد عفونی که مناسب برای استعمال با پوست می باشد، شستشو دهید. اگر به هر شد عفونی کننده ای حساسیت دارید، دستهای خودتان را با آب بشویید و یک رستکش جراحی به دست کنید.

2. درون جعبه را با افشاندن 70% الکل و با خشک کردن توسط پارجه ی سترونی، ضد عفونی کنید.

3. کلیه ی اقلامی را که شما در نزدیکی یا درون جعبه نیاز خواهید داشت را جمع آوری و مرتب کنید.

4. در داخل کابینت عمل کنید و یک تکه ی ضد عفونی شده ای از ساقه را از قالب، با یک جفت پنس بردارید ( مواد گیاهی را با دستتان لمس نکنید ) .

ادوات خودتان را همچنین با فرو بردن آنها در الکل، بین هر دستکاری و مشتعل کردن آنها ضد عفونی ( سترون ) کنید.

تکه های کوچک، دارای 3_2 سانتیمتر طول، و برگهای اندک، می توانند برش یابند، و به محیط کشت آگار منتقل شوند.

اگر برگها خیلی بزرگ بودند، آنها را نیز در اندازه های 2/1- 3/1 برچینید یا ببرید.

یک قطعه ( تکه ) از پاجوش را داخل ظرف کشتی قرار دهید ( مهم است که در این مرحله تنها یک پاجوش در هر ظرف کشت داشته باشیم، برای اینکه اگر پاجوشی آلوده شد، نتواند به پاجوش های دیگر پخش شود ).

دریچه های ظروف کشت را ببندید. قالب ها را در دمای اتاق دور از نور مستقیم خورشید نگه دارید.



تکثیر شاخه :

شاخه ها ممکن است درمرحله قبلی دراز شده باشند پس از گذشت 4 هفته ،آنها نیاز دارند به آماده سازی که انتقال یابند به محیط کشت که حاوی شیر نارگیل برای تکثیر بیشتر است.

تکرار و استریل کردن محیط کشت ،ابزار ها و اتاقک . شما نیز باید از قبل دستهایتان را استریل کرده باشید.

انتقال ظرفهای حاوی شاخه ها به یک طرف کابینت و محیط کشت استریل شده به طرف دیگران

استفاده کردن از پارچه های کاغذی ،پنس و چاقوهایی که قبلا" استریل شده اند.

با یک جفت پنس ، ساقه ها را از ظرفهایشان برداشته و آنها را درسطح پارچه کاغذی استریل شده که مرطوب است قرار دهید.

این نکته مهم است که همیشه پارچه های کاغذی را مرطوب نگه دارید تا اینکه گیاهان همیشه لطیف و میتوانند به زودی خشک شوند.

شاخه های جدا شده می توانند به شیشه های جدیدی انتقال یابند. در این مرحله حداکثر 5 تکه از گیاهان ممکن است در درون هر ظرف قرار داده شود.

نگه داری کشت هایی که در مرحله قبل توسعه یافته اند . مرحله تکثیر ممکن است تکرار شود. هر 4 هفته تا زمانی که گیاهان کافی بدست آمده باشد.

بطور کلی شاخه ها می توانند تکثیر شوند 3-4 دفعه از هر 4 هفته .

نکته مهم توجه کردن به این نکته است برای جلوگیری از آلودگی در طی این مرحله شما می توانید هوای آلوده را بگیرید زیرا این هوا باعث کاهش بهداشت می شود.

تشکیل ریشه :

زمانی که شماشاخ ها را به اندازه کافی ثابت کردید . شما می توانید اجازه رشد دهید به آنها قبل از آنکه مراحل ریشه دهی شروع شود . شاخه ها به خاطر ریشه دهی به محیط کشتی که حاوی شیر نارگیل و جوانه جواست انتقال می یابند. حداکثر 5 شاخه در هر ظرف کشت قرار داده می شود. ظرف ها در جایی که قبلا" نگه داری می شدند قرار میگیرند . ریشه ها بایستس در عرض 2تا 4 هفته تشکیل شوند.

انتقال به آمیخته گلدانی :

عمل مهم در این مرحله انتقال گیاهان به فضای آزاد است .گیاهان ریشه دار شده بصورت زیر نگهداری شوند:

پر کردن گلدانها با آمیخته گلدانی مناسب بدون هیچ حاصلخیزی وآب کافی و ثابت کردن میزان آبیاری .

انتقال گیاهان ریشه دار شده از محیط کشت آگار با استفاده از یک جفت پنس .

شستشوی آگار ها با آب ولرم به علت وجود ریشه ها .

ایجاد حفره در محیط کشت آمیخته خاکی و قرار دادن ریشه ها درداخل حفره ها به آرامی

اسپری کردن شاخ و برگ با استفاده از اسپری دستی حاوی آب،این گلدانها می توانند درداخل ظروف پلاستیکی بزرگتر با یکپوشش شیشه ای ودور از نور مستقیم آفتاب نگه داری شوند.

زمانی که ریشه ها به اندازه کافی ثابت شدند و سازگاری یافتند . آنها می توانند حاصلخیز شده و پرورش یابند مانند سایر درختان افزایش تدریجی نور نیز برای گیاهان لازم است.

جهش زایی در درون شیشه :

موزهای خوراکی اغلب پلی پلو ئیدهای استریل هستند و باید به طریقه رویشی از دیاد یابند. از جهت اصلاح ژنتیکی با دورگه گیری امکانپذیر نیست . روش جهش زایی پیشنهاد می شود که یک پیشنهاد بسیار عالی برای نزدیک شدن به اصلاح موز می باشد. علاوه بر این ، هتروزیگوت بودن کلون های غیر جنسی موز آنها را برا ایجاد جهش مناسب می سازد. حالت های هتروزیگوتی در مکان های ژنی کولیتوارهای دیپلوئید Aa بوده در صورتی که انواع ژنومیکی تریپلوئید می تواند به شکل Aaa بوجود آید. برای هیبریدها ی برون گونه ای ، اشکال هتروزیگوتی می تواند به صورت AaB و Aab AAb, ABb, aBb,aBB باشد. ایجاد جهشی ممکن است فنوتیپ مغلوب را توسط تغییر ،باز داشتن یا حذف آلل های غالب مشابه به ظاهر کند . با استفاده از کشت نوک شاخه ها به منظور جهش زایی ، ایجاد جهش و تولید مونانت ها را آسان می کند.

انتخاب بیشتر 60Gy GN-در مالزی منجر به تشخیص میوه دهی زود رس در موز کاوندیش شده بود که Vovaria نام گرفت. Matsunoto و Yumagushi موتانت مقاوم به آلومینیوم را که از طریق پرتو افکنی پروتوکروم موز کاوندیش بوجود آمد ه بود انتخاب کردند . Pisang Berangan یک موزمشهور که میوه دهی ،گلدهی ،رنگ ،بافت گوشتی و اندازه دارد. به هر حال ،این موز نسبتا" گراز بوده و نیز خیلی زود به بیماری پژمردگی فوزارومی دچار می شود و بیماری Freckle (لکه دار شدن ) باعث می شود توسط Clod spurious mesa در نتیجه یک برنامه جهش زایی استفاده ازاعه گاما را برای القاء تنوع ژنتیکی آشنا کرد تا اینکه گیاهان توانستند با یک یا چند صفت گلدهی انتخاب شوند:

تحمل به بیماری Panama

گیاهان پا کوتاه

زود میوه دهی ووزن خوشه ای بالا



اندام زایی توسط کالوس (در بنفشه آفریقایی )

در این روش ، برا ی تکثیر ریز نمونه ها ،کالوس بدست می آید که بعد ها به اندام هایی مانند شاخه و ریشه تبدیل می شوند. تمایز اندام بوسیله نسبت سیتوکنین به اکسین کنترل می شود که این نسبت در کشت بافت خیلی مهم است . میزان کم هر دو برای کالوس زایی ضروری می باشد . به هر حال ،اگر سطح سیتوکنین نسبت به سطح اکسین بالا باشد جوانه ها ظاهر می شوند . اغلب جوانه هایی بدست می آیند که بعدا" خودشان بتوانند به آسانی ریشه داده و قلمه چوب نرم تولید نمایند.

بنفشه آفریقایی یک گیاه گلدار خانگی است. این گیاه می تواند به آسانی توسط قلمه تکثیر یابد. همچنین آن می تواند دورن شیشه نیز پرورش یابد. ریزازدیادی یکی از روش های موفقیت آمیز جهت تولید تجاری این گیاه می باشد.

زمانی که گوشوارک یا پهنک برگ روی محیط کشت Skog وMurashinge قرار می گیرد که حاوی سطوح ویژه ای اکسین و سیتوکنین است.آنها کالوس هایی را تشکیل می دهند که بعد می تواند به اندام ها تمایز یابد. این آزمایشات ،نقش اکسین و سیتوکنین را در تمایز ریشه ها و شاخه ها نشان می دهد. محیط کشت هفته قبل آماده می شود مگر آنکه شامل تنظیم کننده های رشد گیاهی زیر باشد :

BA 1/0 PPm و NAA 1/0 PPM .

برگهای بنفشه آفریقایی را روی سطح استریل شده ای به مدت 10 دقیقه در ماده پاک کننده کلراکس قرار دهید ،سپس 3 بار در آب استریل شده قرار دهید و بعد از آن تقطیر کنید و در پتری دیش های استریل شده ای برای استفادیتان بگذارید. .ضمنا" موارد زیر را رعایت کنید.

از تکنیک های استریل استفاده کنید و برگها را به پتریدیش استریل شده یتان انتقال دهید.

پهنک برگ را به صورت 6 متر مربع مساوی برش دهید .( 5/1cm * 5/1 cm)

درب شیشه را باز کرده و دوقسمت از برگها و محیط کشت را در درون شیشه قرار دهید و این عمل رابرای شیشه های دوم وسوم نیز تکرار نمایید.

درب را سر جای خود گذاشته و شیشه ها را در برابر هود ترانسفر قرار دهید.

نباید شیشه ها و درب های آنها بر چسب دار باشند.

همه گیاهان را باد در هفته های آینده بتوانید مشاهده کنید.

تکنیک ها ی آلوده در کشت بافت :

در اطرافمان اسپورهای قارچی و سایر میکرو ار گانیسم ها قرار دارند . زمانی که یک اسپور در مجاورت محیط کشت قرار می گیرید ،شرایط برای رشد و جوانه زدن آنها مهیا است . هود های ترانسفر تحت شرایط فشار بالایی عمل می کنند و به فیلترهای هوا ی فوق العاده موثر (HEPA) مجهزند که تقریبا" 3 اینچ ضخامت دارند. فیلتر های HEPA 99/99% در انتقال موادی به اندازه 3/0 میکرول و یا بیشتر موثرند و لی باکتری و اسپورهای قارچی توسط این فیلتر ها شکار می شوند . اگر شما از تکنیک های صحیح جهت کار کردن درون این هود ها استفاده کنید آلودگی کشت های بافت گیاهی واقعا" می تواند حذف شود . نکات زیر در به حداقل رساندن مشکلات کمک خواهد کرد :

ساعت و جواهرات خود را در آورید و دستهایتان را بشوئید.

اسپری کردن زیاد دستها و بازوهایتان با اتانول 70% مهم است.

هر چیزی که وارد هود ترانسفر می شود باید استیل شود. اسپری کردن تک تک ابزارها ،شیشه ها و سایر ظروف با اتانول 70% مهم باشد.

در موقعیتی قرار گیرید که صورتتان در ارتباط با جریان هود حداکثر دستهایتان را بیرون از هود نگه دارید. برای دسترسی به داخل هود حداکثر بازوهایتان را دراز کنید اما بازوهایتان را روی سطح کار قرار ندهید.

اگر ضروری باشد که سرفه یا عطسه کنید ، لطفا" این کار را به طرف هود انجام ندهید . اگر شما هود را آلوده کنید ،شما ممکن است نابود کنید کشت های همه دانشجویانی که همراه شما هستند . اگر شما بدانید که هود آلوده است ،لطفا" آن را قبل ازاستفاده دیگران تغییر نمایید.

پنس ها ،چاقو ها و سایر ابزار ها را تک به تک روی شعله بگیرید. ابزار ها را در الکل 95% قرار داده و سپس به مدت کوتاهی از روی شعله بگذارید . الکل ها در بار دوم گرما دادن ابزار ها برای استریل کردن آنها ضروری نیست وچاقو ها و پنس های گرم به بافت گیاهی آسیب خواهند رساند



------------------------------

------------------------------

یافته های نو در مورد کشت بافت چغندر قند

عنوان یافته تحقیقاتی: ریزازدیاد کلونی ژنوتیپهای منتخب به روش کشت درون شیشه

مقدمه: چغندرقند یک گیاه دو ساله و دگرگشن است. تکثیر غیر جنسی این گیاه به روش ریزازدیاد کلونی در شرایط درون شیشه موجب دستیابی به یکنواختی بیشتر در اجرای آزمایشهای ترکیب پذیری و نیز حفظ منابع ژنتیکی مورد نیاز برنامه های بهنژادی این گیاه می گردد. تولید جوانه های نا به جا از بافتهای گوناگون امکان پذیر است. با توجه به این که صفات زراعی بوته های انتخاب شده در سال اول مورد بررسی قرار می گیرد استفاده از بافت ساقه گلدهنده پس از اجرای این بررسیها بهترین نتایج را حاصل می آورد. بافت ساقه گلدهنده بوته های مورد نظر پس از نمونه برداری در آزمایشگاه استریل می گردد و در محیط های غذایی منتخب حاوی هورمونهای رشد در چرخه ازدیاد قرار می گیرد.

شرح یافته وتوصیه های کاربردی: آزمایشهای به اجرا در آمده موجب کسب نتایج معتبر و قابل تکرار در زمینه مراحل مختلف کشت در شرایط آزمایشگاهی گردیده است. ساقه گلدهنده گیاه ورنالیزه شده چغندرقند پس از شستشو و استریلیزاسیون با محلول الکل 70% و سپس با هیپوکلریت سدیم 2-1% و آبکشی با آب استریل در محیطهای 1- القا جوانه های رویشی 2- ازدیاد جوانه ها 3- ریشه زایی حاوی ترکیب نمکهای اصلی و فرعی, هورمونهای رشد، قند و ماده آگار کشت می گردند. میزان ازدیاد جوانه ها در ژنوتیپها متغیر است اما در هر چرخه 4 هفته, این میزان بین 5 و 7 برابر می باشد. نگهداری جوانه ها در محیط سردخانه و نور ملایم امکان پذیر می باشد.

روش ازدیاد و نگهداری جوانه های رویشی حاصل از ریزازدیاد کلونی ژنوتیپهای برتر در شرایط درون شیشه در حال حاضر بخشی از عملیات مورد نیاز در برنامه های بهنژادی بسیاری از گیاهان از جمله چغندرقند می باشد.

اهمیت اقتصادی: یکنواختی، تکرارپذیری عملیات دورگ گیری و نگهداری منابع ژنی مورد استفاده در برنامه های به نژادی موجب تسهیل و تسریع در امر دستیابی به نتایج تلاقی های گونه های زراعی و نیز گونه های وحشی و معرفی ارقام جدید چغندرقند می گردد.



ریزازدیاد کلونی

عنوان یافته تحقیقاتی: تولید گیاهان هاپلوئید و دابل هاپلوئید با استفاده از روش کشت تخمک بارور نشده و تیمار کلشی سین در شرایط کشت درون شیشه

مقدمه : کشت گامت در گیاهان با هدف شناسایی و تثبیت برخی از صفات زراعی و نیز ایجاد گیاه هاپلوئید به اجرا در می آید. در اغلب گیاهان کشت دانه گرده با موفقیت روبرو شده است، در حالی که در چغندر قند کشت این سلول به نتیجه نرسیده و تخمک بارور نشده منشا تولید گیاهان هاپلوئید قرار گرفته است. آزمایشهای گوناگون در رابطه با نمونه قابل کشت، محیط کشت مناسب و ترکیب هورمون ها به اجرا در آمده است. در پژوهشهای به اجرا در آمده در ایران لاینهای هاپلوئید حاصل از کشت تخمک بدست آمده است. اجرای تیمار کلشی سین برای دو برابر کردن تعداد کروموزمهای گیاهان هاپلوئید در آزمایشهای مختلف مورد بررسی قرار گرفته و نهایتا در شرایط کشت بافت هاپلوئید درون شیشه های کشت به کار گرفته شده است.

شرح یافته و توصیه های کاربردی: اجرای کشت تخمک بارور نشده با نمونه برداری از بوته های ورنالیزه آغاز می گردد. ساقه هایی که گلی در قاعده آنها شکفته باشد جهت برداشت انتخاب می شوند. از این ساقه ها پس از استریلیزاسیون در محیط استریل با استفاده از لوپ بینوکولر تخمک های بارور نشده از دورن غنچه گل خارج و در محیط غذایی انتخاب شده N6 حاوی هورمونهای NAA و BA و میزان قند 6% کشت گردید. میزان جوابگویی ژنوتیپها بین 1 تا 5/10% ثبت شده است. بافت و گیاهچه های هاپلوئید در محیط ازدیاد تکثیر و در شرایط دورن شیشه با محلول کلشی سین در غلظت 05/0% به مدت 48 ساعت تحت تیمار قرار می گرفت. جوانه های حاصل از بافت و گیاهچه های در حال تکثیر در محیط عاری از این ماده سطح پلوئیدی مضاعف نشان داده است . این گیاهان به نام گیاهان دابل هاپلوئید (DH) چغندرقند دارای ژنوم تثبیت شده می باشند.

اهمیت اقتصادی: لاینهای دابل هاپلوئید به عنوان والد هیبرید برای افزایش میزان هتروزیس در برخی صفات زراعی و نیز به عنوان منابع ژنی با صفات تثبیت شده مقاومت به بیماریها و آفات به کار می روند. کاهش دوره سلکسیون برای تثبیت ژنها از مهمترین امتیازات اجرای روش هاپلودیپلوئیدیزاسیون در گیاهان می باشد و به ویژه در گیاهان دگر گشن حائز اهمیت است.





عنوان یافته تحقیقاتی: تولید جنین سماتیکی چغندرقند از طریق اجرای تیمار TIBA/Proline در شرایط جوانه

زنی بذر و اجرای کشت درون شیشه

مقدمه : تولید جنین غیر جنسی یا رویشی در شرایط کشت درون شیشه یکی از روشهای جدید ازدیاد رویشی گیاهان تلقی می گردد. در این روش سلولهای رویشی بافت گیاه در شرایط کشت مصنوعی ایجاد بافت جنین زا می نماید و جنین های رویشی حاصل که مشابه جنین های زایشی به مرحله رسیدگی می رسند یکنواختی ژنتیکی بیشتری دارند. دستیابی به جنین های رویشی در برنامه های به نژادی و تولید بذرتجاری به منظور انتقال ژن، ایجاد مقاومت به تنش های گوناگون، بررسیهای مولکولی و تولید بذر مصنوعی مورد توجه قرار دارند.

شرح یافته وتوصیه های کاربردی: در این تحقیق بافت کوتیلدونی و هیپوکوتیل جوانه بذری لاین دیپلوئید منوژرم 9597 و متعاقباً قطعات کوچک بافت کال برای ایجاد کشت سوسپانسیون سلولی به کار رفته است. استفاده از آنتی اکسین TIBA و اسیدآمینه پرولین، موجب دستیابی به یک روند القا ، باززایی و رشد جنین های رویشی یا سوماتیکی گردیده است. استفاده از آنتی اکسین در القا جنین زایی در چغندرقند و پرولین در روند تکاملی بافت جنین زا توصیه می گردد.

اهمیت اقتصادی: ازدیاد رویشی یکنواخت یک گیاه برای برنامه بهنژادی این گیاه نیروی پتانسیل عظیمی ایجاد می نماید که اگر مورد بهره برداری صحیح و علمی قرار گیرد زمینه های مختلف کاربردی دارد. از جمله انتقال ژن و دستیابی به گیاهان ناقل ژن مطلوب زراعی در چغندرقند.



جنین های رویشی چغندرقند



عنوان یافته های تحقیقاتی: تلاقی بین گونه أی چغندرقند Beta vulgaris با گونه های وحشی گروه Procumbentes و کنترل ماهیت هیبرید توسط مارکرهای مولکولی RAPD

مقدمه : گونه های وحشی چغندرقند از جمله گونه های گروه Procumbentes به علت دارا بودن ژنهای مقاومت به آفات و بیماریها مورد توجه به نژادگردان قرار گرفته است. در این تحقیق تلاقی بین چغندرقند L. Beta vulgaris توده تتراپلوئید 37RT (والد مادری) و سه گونه وحشی (والد گرده افشان) به شرح زیر انجام گرفت.

37RT(4n) × B. webbiana(2n) , 37RT(4n) × B. procumbens(2n) , 37RT(4n) × B. patellaris (4n)

برای اجرای تلاقی، بساکها از گلهای والد مادری حذف شد و بعد از 2 الی 4 روز با گرده جمع آوری شده تلقیح به طور دستی انجام شد. مطالعه مراحل نمو جنین با واکنش تخمک های باور شده به محلول 1% تترازولیوم کلراید کنترل شد. جنین های کامل در محیط کشت N6 حاوی هورمونهای NAA , BA, GA3 کشت گردید.کنترل ماهیت هیبریدها با استخراجDNA برگ گیاهان بدست آمده در شرایط درون شیشه و استفاده از روش PCR با پرایمرهای تصادفی OPX2, OPX15 به اثبات رسیده است.

شرح یافته وتوصیه های کاربردی: نتایج حاصل از بررسیها نشان داد که ایجاد هیبریدهای بین گونه أی از طریق نجات جنین در شرایط کشت درون شیشه امکان پذیر است. جنین های مورد مطالعه در روز بیستم پس از تلقیح کاملا رشد یافته بودند و این زمان جهت کشت تعیین گردید. در مراحل اولیه ریشه زایی توسط این جنین ها در چند مورد مشاهده شد اما این ریشه ها نکروزه گردیدند. ماهیت هیبرید گیاهان بدست آمده در ظروف کشت با استفاده از تکنیک PCR و پرایمرهای OPX2 , OPX15 کنترل گردید. وجود باندهای مشترک گیاهان والد در مکان مشخص در هیبرید ها به اثبات رسید. ایجاد تنوع ژنتیکی از طریق اجرای تلاقی بین گونه أی و کنترل هیبریدها در سطح مولکولی در برنامه بهنژادی چغندرقند قابل توصیه می باشد.

اهمیت اقتصادی: استفاده از گیاهان دورگ که دارای ژنهای مقاومت به بیماریها و آفات می باشند در برنامه بهنژادی چغندرقند اهیمت به سزایی در افزایش سطح زیر کشت، عملکرد محصول و کاهش مصرف سموم دفع آفات خواهد داشت.



جنین هیبرید بین گونه ای کامل



باندهای حاصل از PCR پرایمر تصادفی

عنوان یافته تحقیقاتی: بررسی میزان مقاومت به تنش شوری در لاینهای سلولی و بافت جوانه زای چغندرقند در شرایط درون شیشه

مقدمه : از سال 1367 در ایران آزمایشهای متعددی در ارتباط با ارزیابی مقاومت به شوری در گیاه چغندرقند در شرایط آزمایشگاهی در مرحله جوانه زنی و رشد گیاه کامل در محیط گلخانه و مزرعه صورت گرفته است. میزان مقاومت به شوری در سطح رشد سلولی در شرایط درون شیشه با شرایط تنش در گیاه کامل تطبیق دارد. باتوجه به نتایج مفید تحقیقات به اجرا درآمده (1371 و 1375) ارزیابی این مقاومت در لاینهای سلولی و بافت کوتیلدونی جوانه زای چغندرقند در شرایط درون شیشه بررسی شد. منابع گیاهی حاصل از آزمایشها در مراحل بعدی از نظر تفاوتهای موجود در سطح مارکرهای مولکولی کنترل می گردند.

شرح یافته وتوصیه های کاربردی: در آزمایشهای به اجرا در آمده بافت هاپلوئید باززا حاصل از کشت تخمک بارور نشده و بافت کوتیلدونی جوانه بذری در سطوح 100، 150 و 250 میلی مول نمک کلرورسدیم کشت گردیدند و جوانه های باززایی شده در کلیه موارد در شرایط رشد ازدیادی قرار داده شدند. این جوانه ها به عنوان منابع گیاهی مقاومت به شوری نگهداری خواهد شد. در حال حاضر از لاینهای 261, H261.06 لاین نر عقیم و گرده افشان، 9597 و7233 جوانه های سلکسیون شده در سطوح بالای نمک موجود می باشد. به کارگیری محیط تنش شوری در آزمایشهای به نژادی گیاهان جهت ارزیابی های گوناگون در سطح بافت و یا مولکولی توصیه می گردد.

اهمیت اقتصادی: استفاده از شرایط کشت درون شیشه درآزمایشگاه با کنترل عوامل محیطیشرایط آزمایشی یکنواخت و قابل اطمینانی را فراهم می سازد که در جوار آزمایشهای مزرعه می تواند موجب فراهم شدن تسهیلات و تسریع در پیشبرد اهداف به نژادی گردد.





شناسایی تحمل به شوری در لاین سلولی هاپلوئید باززا



عنوان یافته تحقیقاتی: جداسازی و کشت پروتوپلاست چغندرقند و تولید بافت باززا در شرایط درون شیشه

مقدمه : بهره برداری از توان باززایی گیاه کامل توسط یک سلول گیاهی می تواند موجب وسعت عمل در انتخاب و انتقال مزرعه آزمایشی به روی میز کار آزمایشگاه گردد. به نژادگر می تواند با استفاده از یک گرم بافت گیاهی تعداد 105×23 پروتوپلاست گیاهی را در یک میلی لیتر محلول شناور سازد و مطالعات گوناگونی را به اجرا بگذارد. بررسی جداسازی و کشت پروتوپلاست لاینهای چغندرقند شامل انتخاب محلول آنزیمی، بافت مناسب که بتواند منشا پروتوپلاست باشد و نیز روش خالص سازی و کشت پروتوپلاست بوده است. بافت مزوفیل برگ دارای کلروپلاست و نیز بافت سوسپانسیون سلولی فاقد کلروپلاست و دارای قدرت باززایی زیاد در این بررسیها به کار گرفته شد.

شرح یافته وتوصیه های کاربردی: مناسبترین ترکیب، غلظت و مدت تیمار آنزیمی جهت جداسازی پروتوپلاست به شرح زیر تعیین گردید.

بافت مزوفیل برگ : سلولاز RS (g/l 5) + دری سلاز (g/l 1) + پکتیناز (g/l 5)

بافت سوسپانسیون سلولی : سلولاز RS (g/l10) + دری سلاز (g/l2) + پکتیناز (g/l10)

خالص سازی در شرایط ایده آل : دستیابی تراکم105× 23 پروتوپلاست در میلی لیتر منجر گردید.

کشت پروتوپلاست و تشکیل میکروکالها در محیط غذایی K8P و سپس N6 و محیط جنین زایی باعث ایجاد کالوس جنین زا گردید. استفاده از بافت سوسپانسیون سلولی با منشا کالوس جنین زا و تازه موجب افزایش باززایی پروتوپلاست های ایجاد شده گردید. بنابراین به نظر می رسد که به هنگام بهره گیری عملی از این تکنیک بافت فوق بر بافت مزوفیل ارجحیت دارد.

اهمیت اقتصادی: با تکمیل تحقیقات مربوط به کشت پروتوپلاست، از تکنیک فوق می توان در موارد زیر بهره مند گردید :

1-مهندسی ژنتیک چغندرقند ، 2 - انتقال ژن از طریق امتزاج پروتوپلاست ، 3- مطالعات پایه علوم سلولی

دستیابی به این فن آوری در زمینه آموزش متخصصین و پیشبرد تحقیقات در داخل کشور از اهمیت بسیار برخوردار است.





عنوان یافته تحقیقاتی: غربال نمودن لاینهای چغندرقند از نظر مقاومت به تنش شوری در مرحله جوانه زنی بذر در شرایط درون شیشه

مقدمه : ارزیابی میزان مقاومت ارقام و یا لاینهای چغندرقند در شرایط آزمایشگاهی با استفاده از محیط کشت غذایی حاوی نمک کلرورسدیم در مرحله جوانه زنی بذور که مرحله حساس زراعت در ارتباط با مقاومت به شوری می باشد برای تعدادی از لاینهای مقاوم و حساس به اجرا در آمده است. مطالعات فیزیولوژیک و مرفولوژیک برای این ارزیابی به کار گرفته شد. وضعیت ظاهری گیاهچه ها و بروز علائم تنش در اندامهای گیاهچه مورد توجه قرار گرفت. سطوح آزمایشی نمک برای ایجاد شرایط جوانه زنی در محیط کشت با ارزش هدایت الکتریکی (EC) 16 و 24 تنظیم گردید.

شرح یافته وتوصیه های کاربردی: در محیط غذایی با هدایت الکتریکی 16 و 24 تعداد 20 لاین از منابع منوژرم و مولتی ژرم مورد ارزیابی قرار گرفته و پس از یک هفته یادداشت برداری جوانه زدن شروع شد بعد از چهار هفته (28 روز)بذرهای جوانه زده یادداشت برداری و ثبت گردید. با استفاده از طرح آماری کاملا تصادفی با دو تکرار نسبت به محاسبات آماری اقدام و درصد جوانه زده ها در هر هدایت الکتریکی جداگانه برآوردشد. مشخص گردید در (EC) 24 میلی موس بر سانتیمتر لاین های شماره 3 و 4 از اوریژین 7233 و لاین های 38 و 138 از اوریژین 8001 در مقایسه یا سایر اوریژن ها در این محیط درصد جوانه بیشتری داشتند این منابع جمع آوری و در جهت تکثیر و نگهداری آن اقدام شد.

اهمیت اقتصادی: با به کارگیری روش های آزمایشگاهی و بخصوص محیط کنترل شده که حاوی غلظت های متفاوت نمک است در مقایسه با روش های مزرعه و گلخانه حداقل 50% در هزینه صرفه جویی می شود. این لاین های انتخاب شده از نظر ارزش تحقیقاتی هر کدام بیش از چند هزار دلار برای موسسه اهمیت دارد. اگر موسسه بخواهد چنین منابعی را از خارج وارد نماید در چهارچوب یک قرارداد علمی و تحقیقاتی و با پیش بینی پرداخت حق قرارداد زیاد (حداقل 20000 دلار) انجام گیرد. از این منابع در ایجاد واریته های مقاوم به شوری استفاده خواهد شد.





غربال کردن لاین ها



عنوان یافته های تحقیقاتی: ارزیابی جوابگویی به روش ریزازدیاد کلونی در توده های تتراپلوئید چغندرقند

مقدمه : روش ریزازدیاد کلونی به عنوان روش ازدیاد غیر جنسی گیاهان به ویژه گیاهان دگرگشن به دلیل نیاز به ازدیاد پایه های منتخب برای اجرای تلاقیهای مورد نظر در به نژادی از اهمیت زیادی برخوردار است. باتوجه به این که توده های تتراپلوئید به عنوان والد گرده افشان بذر تریپلوئید چغندرقند در تلاقی های گوناگون وارد می گردد، ارزیابی جوابگویی این توده ها به روش ریزازدیاد کلونی در امر نگهداری کلون های نمونه یا سلکسیون شده مورد نیاز می باشد.

شرح یافته وتوصیه های کاربردی: در آزمایش مقایسه جوابگویی مراحل القا جوانه رویشی و سپس ازدیاد جوانه های رویشی در چرخه ازدیاد از بوته های توده های Lit13, C3-3, 37RT, 19669 نمونه گیری انجام گرفت. نمونه های استریل در محیط غذایی PGOB حاوی هورمونهای IBA, GA3, BA در مرحله القا جوانه رویشی و در همان محیط حاوی هورمونهای IBA, BA NAA, مرحله ازدیاد قرار گرفتند. در میان تودها، نمونه های توده C3-3 به واسطه بالاترین تعداد جوانه رویشی القا شده. با سه توده دیگر تفاوت معنی دار نشان داد، اما میزان نهایی ازیاد جوانه در مرحله دوم با تعداد جوانه القا شده متناسب نبودتولید جوانه نمونه های توده 37RT در هر دو مرحله یکنواختی بیشتری نشان داده میزان ازدیاد جوانه در مرحله دوم به عوامل دیگری چون اندازه، قدرت، شکل و تعداد برگها در جوانه القا شده اولیه ارتباط پیدا می نماید.

برای پیشبرد امر ریزازدیادکلونی در توده های گوناگون، تعداد اولیه نمونه باید مد نظر قرار گرفته شود و در مرحله ازدیاد رویشی جوانه ها از نظر عواملی همچون اندازه، قدرت رشد، تعداد برگ، سلامت ظاهری و شکل طبیعی انتخاب گردند.

اهمیت اقتصادی: با توجه به این که افزایش میزان تولید جوانه رویشی در مرحله ازدیاد موجب استفاده بهتر از امکانات شرایط رشد در محیط مصنوعی می گردد. نگهداری نمونه های پر بازده که جوابگویی بالاتری به شرایط رشد در محیط مصنوعی دارند مقرون به صرفه تر است.





-----------------------------------------

-----------------------------------------

تکثیر خرما به روش کشت بافت





کشت بافت گیاهی عبارت است از تکنیکی که برای تولید و تکثیر گیاه کامل از بخش هایی مانند سلول یا بافت گیاه استفاده می شود . این نوع تکثیر موسوم به تکثیر خرد یا ریزازدیادی بوده و با دو روش تولید گیاهک از طریق اندام زائی و جنین رویشی یا گیاهک زائی امکان پذیر می باشد . در هر دو روش وجود یک محیط آزمایشگاهی استریل و استفاده از هوای تصفیه شده الزامی است . خوشبختانه در سال های اخیر تکنولوژی تولید نهال کشت بافت خرما به کشور وارد شده و به حالت بومی درآمده است .







فوائد تکثیر خرما به روش کشت بافت



1) درختان خرمای حاصل از کشت بافت کاملاً شبیه به والدین می باشد(True To Type) بنابراین کلیه صفات والد نظیر مقدار محصول؛ وضعیت رشد؛ مقاومت به بیماری و آفات به گیاهان تولید شده منتقل می شود .

2) امکان تولید انبوه نهال شبیه به گیاه مادری وجود دارد .

3) واریته های کمیاب خرما را می توان در مقیاس وسیع تولید کرد .

4) تکثیر نخل خرما به روش کشت بافت را می توان در هر زمان و هر فصل انجام داد بنابراین تحت تاثیر شرایط فصلی نمی باشد .

5) مدت زمان تولید نهال به حد قابل ملاحظه ای کاهش می یابد .

6) امکان تولید ارقام ماده برتر و سالم ؛ واریته های مقاوم به بیماری ؛شوری و تنش های محیطی و همچنین تولید انبوه پایه های نر پرگرده با ویژگی های متازنیایی مطلوب وجود دارد .

7) نهال کشت بافت دارای سیستم ریشه ی توسعه یافته می باشد بنابراین درصد بقاء آنها در مزرعه حدود 100% است.

8) نهال کشت بافت در هرزمان از سال قابل کاشت در زمین اصلی می باشد .

9) هویت نهال حاصل از کشت بافت مشخص و تضمین شده است .

10) انتقال نهال راحت تر و هزینه آن کمتر است .

11) بدلیل استفاده از گیاهان بدون آلودگی ؛ خطر انتشار آفات و بیماری های نخل از یک منطقه به منطقه دیگر وجود ندارد و یا بسیار نادر است .

12) گیاهان حاصل از کشت بافت ؛ باغات یک دست از نظر ساختار ژنتیکی و ظاهری؛ رشد سریع و ثمردهی زود هنگام را تولید می کنند .

لازم به ذکر است که عملکرد ؛ کیفیت و وضعیت رشد ارقام مختلف خرما در مناطق خرماخیز کشور متفاوت است . این تاثیر مربوط به ارتفاع منطقه از سطح دریا؛ نوسانات دمایی منطقه؛ رطوبت نسبی محیط و سایر عوامل محیطی می باشد بطوریکه کشت برخی از ارقام در بعضی از مناطق اصلاً توصیه نمی شود . به عنوان مثال رقم پیارم در مناطقی که از سطح دریا بالاتر باشند تولید میوه با کیفیت بهتر می کند حال آنکه رقم شهابی بدلیل سازگاری با شرایط مرطوب مناطق ساحلی و تولید محصول خوب در این مناطق توصیه می شود

در حال حاضر با توجه به مناسب بودن ارقام خشک و نیمه خشک خرما ( ارقامی که میوه آن در زمان رسیدن دارای 12% تا 15% رطوبت باشد ) جهت فرآوری ؛ بسته بندی ؛ انبارداری مدت دار و صادرات ؛ تولید ارقام یادشده بیشتر رایج است . با بررسی های انجام شده و تحقیق بر ارقام مختلف تجاری خرما در ایران ؛ ارقام سازگار با هر کدام از استان های خرماخیز کشور به قرار زیر می باشد :



ارقام سازگار خرما قابل توصیه جهت توسعه نخیلات در استان های خرماخیز کشور

استان
ارقام خرمای سازگار با منطقه

بوشهر
زاهدی ؛ شهابی ؛ خاصوئی ؛ برحی ؛ مجول

خوزستان
استعمران ؛ برحی ؛ زاهدی ؛ دیری ؛ خاصوئی ؛ خلاص ؛ حلاوی ؛ بریم ؛ مجول

کرمان
پیارم ؛ زاهدی ؛ مجول

فارس
پیارم ؛ زاهدی

هرمزگان
پیارم ؛ زاهدی ؛ دیری ؛ خاصوئی ؛ برحی ؛ خلاص ؛ توری ؛ مجول

جیرفت و کهنوج
پیارم ؛ زاهدی ؛ استعمران ؛ دیری ؛ توری ؛ مجول

سیستان و بلوچستان
پیارم ؛ زاهدی ؛ ربی ؛ استعمران

یزد
پیارم ؛ زاهدی ؛ کبکاب ؛ بریم ؛ خلاص

اصفهان
خلاص ؛ برحی

سمنان
زاهدی ؛ برحی

خراسان جنوبی
زاهدی ؛ کبکاب

کرمانشاه
زاهدی ؛ اشرسی

ایلام
زاهدی ؛ اشرسی ؛ استعمران




مراحل مختلف رشدی نهال های کشت بافت خرما و گلدان های مناسب جهت نگهداری آن:



1) گلدان تورپیدو یا اژدری A2:



گلدان هایی از جنس پلی اتیلن سیاه رنگ که بدلیل شکل مخروطی و نداشتن سطح اتکا بصورت باکس های 9 و 25 تایی به بازار عرضه می شود . این گلدان برای نگهداری نهال های کشت بافت خرما بعد از خروج از محیط رشد درون شیشه در آزمایشگاه تا زمان تولید 6-5 برگ و افزایش ارتفاع مطلوب حدود 50-40 سانتیمتر مورد استفاده قرار می گیرد .

این شرایط بعد از گذشت 6 -4 ماه از زمان نگهداری نهال های درون گلدان اژدری در گلخانه سازگاری قابل مشاهده می باشد .



2) گلدان پلاستیکی 3 لیتری B1 :



گلدان ها از جنس پلاستیک با رنگ های متنوع و حجم 3 لیتر ( ارتفاع 18 سانتیمتر و قطر 12 سانتیمتر ) می باشند که برای نگهداری نهال های رشد کرده و دارای 5-4 برگ با ارتفاع 50-40 سانتیمتر مناسب می باشد . با توجه به رشد نسبی مناسب در این مرحله ؛ درصورت وجود شرایط مناسب کشت در منطقه نظیر عدم تابش شدید آفتاب و وزش بادهای گرم و خشک و آبیاری کافی ؛ قابل انتقال و کشت در زمین اصلی می باشد . این نهال بعد از 4-3 سال در صورت اعمال مراقبت های لازم به بار خواهد نشست .



3) گلدان پلاستیکی 8 لیتری B2 :



گلدان ها از جنس پلی اتیلن حجم 8 لیتر ( ارتفاع 28 سانتیمتر و قطر 20 سانتیمتر ) می باشند که برای نگهداری نهال های رشد کرده و دارای 6-5 برگ اصلی با طوقه کاملاً مشخص و ارتفاع 80-60 سانتیمتر مناسب می باشد . با توجه به رشد مناسب نهال در این مرحله ؛ درصورت وجود شرایط مناسب کشت در منطقه ؛ قابل انتقال و کشت در زمین اصلی می باشد . این نهال بعد از 3-2 سال در صورت اعمال مراقبت های لازم به بار خواهد نشست .



4) گلدان پلاستیکی 20 لیتری C1 :



گلدان هایی از جنس پلی اتیلن با حجم 20 لیتر می باشند که برای نگهداری نهال های رشد کرده و دارای 9-6 برگ اصلی با طوقه کاملاً مشخص و ارتفاع 100-80 سانتیمتر مناسب می باشد . با توجه به رشد نهایی نهال جهت نگهداری در گلدان نهال در این مرحله قابل انتقال و کشت در زمین اصلی می باشد . این نهال بعد از 2 سال به بار خواهد نشست .

خصوصیات و نکات قابل توجه در گلخانه سازگاری



1 ) کنترل دما



نگه داشتن دما در حدود 30 درجه سانتیگراد (12 درجه سانتیگراد نقطه خطر و ماکزیمم درجه حرارت 35 درجه سانتیگراد).
استفاده از آبیاری کف گلخانه در هنگام وقوع افزایش دما . برای این منظور می توان از سیستم میست یا پاشیدن دستی آب توسط شیلنگ روی کف بتونی یا راهروهای گلخانه استفاده نمود


2 ) ممانعت از تابش مستقیم نور خورشید به روش ذیل :



استفاده از تکنیک سایه دهی یا رنگ پاشی بوسیله حصیر یا برگ های خشک نخل برای جلوگیری از افزایش دما و تابش مستقیم نور آفتاب خصوصاً در فصل بهار و تابستان .
(برای این منظور سطح رویی گلخانه توسط حصیر چوبی یا برگ نخل بطورکامل پوشیده می شود . این حالت پاعث ایجاد سایه و عدم تابش مستقیم نور خورشید به گیاهان می شود و نور عبور کرده از حصیر و درزهای آن کافی خواهد بود )





3 ) کنترل رطوبت :



نصب رطوبت سنج در گلخانه به منظور اطلاع از میزان رطوبت نسبی محیط گلخانه
حفظ رطوبت در دامنه 60 -50 درصد نسبی
استفاده از دستگاه های رطوبت زا یا آبپاشی سطح گلخانه جهت بالابردن رطوبت نسبی فضای گلخانه ها.
کنترل افزایش بیش از حد رطوبت بوسیله هوادهی گلخانه جهت جلوگیری از شیوع امراض قارچی
( با نصب دستگاه رطوبت سنج مجهز به کلید قطع و وصل کننده سیستم میست و هواکش می توان تنظیمات را بصورتی اعمال نمود که با کاهش میزان رطوبت محیط از مرز 45% سیستم میست شروع بکار کرده و در مواقعی که رطوبت از 70% فراتر رود سیستم تهویه ( هواکش) جهت خارج نمودن رطوبت اضافه محیط روشن گردد )



4 ) مبارزه با بیماریها و آفات



سمپاشی دوره ای هر 2 هفته یکبار با قارچ کش و حشره کش های معمول در بازار نظیر بنومیل یا مانکوزب با غلظت 2 در هزار مناسب جهت پیشگیری. 5 ) پوشش کف گلخانه

استفاده از سطح بتونی با پوشش شن به قطر متوسط 5 سانتیمتر جهت ممانعت از رشد و ورود ریشه به خاک زیرین گلدان ضروری است.
نکته:

1) درصورت عدم انجام بتون ریزی، استفاده از گونی ضخیم پلاستیکی بر روی پوشش شنی به جای سطح بتونی الزامی می باشد.



2) در صورت عدم رعایت موارد فوق ‌ریشه نهال به خاک کف گلخانه نفوذ کرده و در هنگام جابجایی نهال بدلیل قطع شدن قسمت اصلی ریشه ضمن وارد آمدن استرس به گیاه احتمال خشک شدن آن پس از کاشت در زمین اصلی بسیار افزایش می یابد.



-------------------------------

-------------------------------

نقش کشت بافت در توسعه کشاورزی

کشت بافت عبارت است از کشت یاخته، بافت، پیش‌دش (protoplast) و اندام‌های گیاهی در شرایط گندزدایی شده و در محیط غذایی مصنوعی در داخل لوله آزمایش. اکنون این فناوری به عنوان یک روش پایه‌ای و یک ابزار محوری بسیار عالی در تکثیر و اصلاح نژاد گونه‌های گیاهی مهم اقتصادی موقعیت ویژه‌ای‌را کسب کرده است. کشت بافت گیاهی در کشاورزی و باغبانی نیز کاربردهای عملی فراوانی دارد. آزمایشگاه‌های ریزازدیادی سالیانه میلیون‌ها نهال درختان و گیاهان زینتی را تولید و به بازار عرضه می‌کنند. کشت انتهای شاخه یا مریستم به منظور تولید گیاهان عاری از ویروس به طور گسترده‌ای در حال اجراست. کشت بساک، تخمک و همجوشی پیش دش‌ها در به‌نژادی با کاهش مدت زمان لازم و افزایش کارایی انتخاب، سرعت عمل را زیاد کرده است و علاوه بر این روش خوبی در درک فرایندهای زادشناختی (Genetic)، تنکارشناختی (Physiology)، زیست شیمیایی و زیست شناسی مولکولی به شمار می‌رود. از طرف دیگر گیاهان تراریخت که از انتقال DNA خارجی به یاخته‌ها و پس‌از باززایی گیاهی حاصل می‌شوند، به سرعت در حال پیشرفت است و تأثیر این محصولات در سلامت انسان در کشورهای اروپایی و آمریکایی تردیدهایی را برانگیخته است.اگرچه دامنه‌ی چنین جنبش هایی به آسیا و آفریقا کشیده نشده است امّا به منزله‌ی هشداری برای همه‌ی ملل جهان تلقی می گردد. اهداف اصلی این تحقیق برمبنای تکوین گیاهان تراژنی مقاوم به حشرات، بیماری‌ها، خطر سرما و علف‌کش‌ها استواراست. همجوشی پیش‌دش‌ها (یاخته‌های فاقد دیواره) امکان تلاقی بین گونه‌ای را مقدور می‌سازد. این روش برای تلاقی‌های بین گونه‌ای اهلی و وحشی اهمیت زیادی دارد، زیرا اولاً نسل اول آن‌ها فاقد رویان تکامل یافته و غیر قابل رویشند و دوماً گونه‌های وحشی معمولاً دارای ژن‌های کنترل کننده مقاومت به آفات و بیماری‌ها و شرایط محیطی می‌باشند. علاوه بر این در بعضی از روش‌های انتقال ژن‌ و تهیه پیش‌دش‌ها یک مرحله‌ی ضروری بوده و دریچه‌ی تازه‌ای در اصلاح نژادی گیاهان زراعی گشوده است. جدول 1 روش‌های مختلف کشت بافت و کاربرد آن را نشان می‌دهد.

روش‌های کشت بافت مبتنی بر دو مرحله تمایز زدایی و تمایزیابی می‌باشد. یاخته‌ها، بافت‌ها و اندام‌های گیاهی در طی مرحله تمایز زدایی، توده‌های یاخته‌ای بی‌شکل و متراکمی به نام پینه را تولید می‌نمایند و سپس در شرایط غذایی و محیطی مناسب تمایز یافته و بافت‌های مختلفی را ایجاد نموده و گیاهان کاملی را به وجود می‌آورند. به همین دلیل کشت بافت در مسائل مربوط به رشد و تمایزیابی تحت شرایط باز تولیدی به آزمایش‌های گیاهی کمک گرانبهایی کرده است. کشت بافت در کشاورزی و باغبانی نه تنها به منظور تکثیر گیاهان بلکه اهداف مربوط به جذب مواد غذایی خاک، مقاومت به شوری خاک، حذف عوامل بیماری‌زا، حفظ ذخایر گیاهی ارزشمند در کشت‌ها و در درجه حرارت‌های پایین و اصلاح گیاهان کاربردهای عملی بسیار وسیعی پیدا کرده است. اهمیت کشت بافت گیاهی به اندازه‌ای است که بسیاری از دانشگاه‌های دنیا آن را در دوره‌های آموزشی پیشرفته و مقدماتی خود گنجانیده‌اند و حتی در بعضی از کشورها دوره‌های تخصصی ریزازدیادی را در سطح تولید سازماندهی کرده اند.

نظریه بس‌توانی (Totipotency) که در سال 1838 توسط شلیدین و شوآن پیشنهاد شد، نیروی محرکه‌ی اصلی توسعه‌ی این شاخه‌ی زی فن شناسی بوده است. بس توانی یاخته‌ای عبارت است از این که یاخته‌های گیاهی در وظایفشان خود سازند و در اصل استعداد باززایی و تولید گیاه کامل را در خود دارند. در ابتدا این نگره فقط در یاخته‌های تخم و هاگ تأیید شد. پس از گذشت مدت زمان طولانی برای یاخته‌ها‌ی بدنی نیز به اثبات رسید. بنابراین، بس‌توانی به عنوان یکی از نشانویژگی‌های یاخته‌های گیاهی، توان بالقوه‌ی بزرگی در به دست آوردن نوترکیب‌های زادشناختی محسوب می‌گردد که با صرف زمان و دشواری‌های بسیاری با روش‌های به‌نژادی سنتی امکان‌پذیر نبوده است. اکنون کشت بافت گیاهی براساس چنین اصولی استوار گردیده و به سرعت در حال گسترش و ترقی می‌باشد.

رواج و کارآیی بالقوه‌ی روش‌های کشت بافت در اصلاح نژاد گیاهی عبارت است از:(1) تکثیر گروهی،(2) حذف عوامل بیماری‌زا،(3) نگهداری ذخایرتوارثی





جدول 1- روش‌های کشت بافت و کاربرد آن در تکثیر و اصلاح گیاهان


کاربرد
روش


گیاهان تک لاد

گیاهان تک لاد

گیاهان تک لاد

دورگ گونه‌های با فواصل نزدیک و دورکه از نظر جنسی ناسازگارند

دورگ‌های بدنی بین گونه‌های دور و نزدیک با ناسازگاری جنسی

ریزازدیادی سریع و حذف ویروس در گیاهان

ریزازدیادی

تکثیر گیاهی

گیاهان تغییر یافته‌ی مهم در کشاورزی

تراریختی گیاهی و تولید بذور مصنوعی

تولید ترکیبات شیمیایی گیاهی

نگهداری دراز مدت منابع زادشناختی گیاهی

گیاهان مهندسی شده به روش زادشناسی یا ترازایی

کشت بساک

کشت ریزهاگ

کشت تخمدان بارور نشده

کشت رویان

کشت پیش‌دش (پروتوپلاست)

کشت مریستم

کشت جوانه جانبی یا گره

کشت سپرچه یا اسکاتولر

تغییر یاخته‌های غیرجنسی

رویان زایی بدنی، نجات رویان

کشت یاخته یا سوسپانسیون یاخته‌ای

سرما نگهداری درون شیشه‌ای

فنون بازترکیبی یا انتقال ژن












به‌مدت زمان‌ طولانی، (4) تولید گیاهان تک لاد (هاپلویید)، (5) ایجاد و انتخاب تغییرات زادشناختی، (6) تولید محصولات ثانویه، (7) انتقال ژن، (8) دورگ‌گیری بین گونه‌‌‌ای و (9) مهندسی زادشناختی مولکولی گیاهی.



کشت پینــه :

پینه زایی یک مرحله‌ی بسیار مهمی از کشت بافت را تشکیل می‌دهد و تولید پینه‌های رویان زا که دارای قابلیت باززایی گیاهی باشند همواره با محدودیت هایی مواجه بوده‌است. از‌این گذشته در مطالعات پینه‌زایی دو عامل مهم زادمون و محیط ( غذا، نور و حرارت) بیش از همه مورد توجه قرارمی‌گیرد. زادمون‌های یک گونه یا زیرگونه پاسخ‌های متفاوتی نسبت به کشت نشان می‌دهند. برای تولید پینه از کشت قطعات یک بافت نامتمایز یا کاملاً تمایز یافته و تبدیل آن به یک توده یاخته‌ای تمایز نیافته با ساختاری بی‌سازمان در محیط ‌های غذایی مصنوعی نیمه جامدی که محتوی همه‌ی مواد غذایی پرمصرف، کم مصرف و ساکارز به اضافه‌ی ترکیبات تنظیم کننده رشد به ویژه 2.4-D ، IAA ، NAA کینیتین و یک ژل نیمه جامد کننده باشد، استفاده می‌شود. قسمت‌هایی از گیاه که می‌تواند کشت شود شامل قطعات ساقه، ریشه. میان برگ(مزوفیل)، لپه، نوک شاخه، بافت گل، کامبیوم آوندی، فلس‌های پیازی، درون دانه، محور رویان، اشعه‌مرکزی، پارانشیم آوندی، سپرچه، محور زیرلپه، بساک، ریزهاگ و تخمک یا تخمدان می باشد. اگرچه اندازه، شکل، منابع گیاهی یا زادمون گیاه و شیوه‌ی کشت در القای تشکیل پینه تأثیر بسزایی دارد اما هر نوع قطعه‌ی زیر کشتی در شرایط محیط غذایی با ترکیبات ویژه ای و دورة نوری خاصی به کشت پاسخ می‌دهد. دانشمندان سی سال پس از شناسایی ترکیب 2 ,4-D به خواص هورمونی آن پی بردند و از آن در تمایز زدایی و تولید پینه استفاده کردند. در حال حاضر استفاده از این هورمون در پینه ز‌ایی به طور وسیعی رواج یافته است. در اغلب گیاهان و قطعات زیرکشت، القای پینه‌ در 25 درجه سانتی‌گراد و در تاریکی انجام می‌شود. پینه زایی از نشانویژگی‌های وراثتی محسوب می‌گردد. علاوه بر این عوامل تنکار شناختی ،منابع گیاهی ، محیطی و تیمارسرمایی پیش از کشت به ویژه در کشت‌های مربوط به بساک و ریزهاگ و تخمک اهمیت زیادی دارد.

کشت باززایی :

یاخته‌های پینه به منظور شاخه زایی و تولید گیاه کامل به محیط‌های غذایی دیگری که از نظر ترکیبات به ویژه میزان و نوع هورمون‌ها با محیط‌های غذایی پینه‌زایی متفاوتند، در شرایط گندزدایی شده انتقال می‌یابند. با تغییر نسبت‌ تنظیم کنندگان رشدی می‌توان برای هر منبع گیاهی، محیط غذایی باززایی مناسبی که بیشترین بازدهی کشت را داشته باشد، تهیه کرد. در تمایزیابی پینه‌ها و به وجود آمدن اندام‌های نو پدید برای هر زاد مونی دوره‌ی نوری و درجه حرارت معینی پیشنهاد شده است. همه‌ی پینه‌ها برای تبدیل شدن به گیاه کامل مناسب نیستند و فقط پینه‌های رویان‌زا که اغلب دانه‌ای شکل، مدور، خشک و زرد کمرنگ هستند، بهتر پاسخ می‌دهند. پینه‌های رویان‌زا پس از عمل تمایزیابی ،اندام‌های اولیه‌ای را به وجود می‌آورند که سپس به شاخه‌ها، ریشه‌ها، گل‌ها، جوانه‌ها و رویان‌ها تبدیل می‌گردند. در غلات محدودیت‌هایی از نظر باززایی گیاهان زال مشاهده می‌شود که گاهی 90 تا 95 درصد تولید گیاه را دربر دارد و برای جلوگیری از این پدیده نامناسب، تحقیقاتی در حال انجام است. باززایی پینه‌از مسائل بسیار پیچیده کشت بافت بوده که در تعداد زیادی از گیاهان، بدون حل باقی مانده است. متأسفانه تعداد زیادی از پینه های گونه ها و همجوشی بین گونه‌ای گیاهان به باززایی پاسخ نمی دهند.









کشت بساک و ریزهاگ :

فنون کشت بساک و ریزهاگ به عنوان یک ابزار اصلاحی کارآمد و صرفه‌جویانه ای در تولید خط‌های جور تخم (هوموزیگوت) گیاهی در مدت زمان کوتاه در به‌نژادی مورد استفاده قرار می‌گیرد. گرده‌ی نارس یا ریزهاگ موجود در بساک در کشت‌های یک مرحله‌ای مستقیماً تولیدگیاه را می‌نماید و در حالت دو مرحله‌ای ابتدا پینه را تولید می‌کند و سپس در شرایط غذایی دیگری با نسبت هورمونی متفاوتی به گیاه باززایی می شود. ریزهاگ‌های داخل بساک تک لادند و نیمی از کروموزوم‌های بدنی را در اختیاردارند. هنگامی که در فرایند کشت بساک به یاخته‌های پینه و سپس به گیاه کامل تبدیل می‌گردند، یاخته‌های بدنی آن‌ها، تماماً تک لاد و در نتیجه گیاه تک لاد خواهد بود و از آن جا که این گیاهان نمی‌توانند تقسیم میوز را انجام دهند، از طریق بذر قابل تکثیر نیستند (در مواردی که پینه‌ها از دیواره بساک به وجود آمده باشند و یا به طورخود به خودی دولاد شده باشند و تولید بذر نمایند، بارورند). بنابراین، این گیاهان بایستی تحت اثر ماده شیمیایی کولشی سین به گیاهان دولاد تبدیل گردند که در آن کروموزوم‌ها به صورت جفت‌های مشابه وجود خواهند داشت و تک لادهای دو برابر یا دولادهای نرزاد (گیاهان گرده‌ای) جور تخم و خالصند و در خط‌های زادگیری (breeding) به منظور بروز صفات زاد شناختی مغلوب ساده یا جهش یافته مورد استفاده قرار می‌گیرند. برتری این روش در مقایسه با دورگ‌گیری سنتی عبارت است از :

1- کاهش مدت زمان لازم به‌نژادی با تثبیت جور تخمی

2- افزایش بازدهی انتخاب به دلیل احتمال بروز سریع ژن‌های مغلوب و پایداری ژن‌های نوترکیب بیشتر

3- تغییر پذیری وسیع زاد شناختی از راه تولید گوناگونی های گامتوکلنی

4- حل مشکل عقیمی در تلاقی‌های دور.

تاکنون کشت بساک بیش از دویست گونه گیاهی شامل غلات (جو، ذرت، چاودار، تری‌تیکال، گندم و غیره)، درختان میوه (سیب ،گلابی، گیلاس،مرکبات وبه)، درختان جنگلی (صنوبر و اوکالیپتوس)، سبزیجات (کلم، هویج، خیار، ترب، بادمجان)، گیاهان زراعی (چغندر و توتون) وگیاهان دارویی نیز به کشت بساک پاسخ داده‌اند. تاتوره اولین گیاهی بود که کشت بساک آن انجام شد. بازدهی کشت بساک به طور وسیعی به زادمون و ساختار زادشناختی گیاه مادری و محیط کشت و شرایط نوری و درجه حرارت اتاق بستگی دارد. در کشت بساک غلات مدت زمان و درجه حرارت دوره سرما دهی و غلظت هورمونی محیط غذایی کشت در میزان تولید گیاهان سبز تأثیر می‌گذارد. از مطالعه باززایی پینه‌های حاصل از نسل اول دورگ‌ها می‌توان چنین استنباط کرد که قابلیت باززایی یک نشانویژگی وراثتی است و توسط ژن‌هایی هدایت می‌شود. از این گذشته در پینه‌هایی که به منظور انتقال ژن با ذرات طلای آغشته به DNA خارجی بمباران می‌شوند و پینه‌هایی که از پیش‌دش‌های امتزاج یافته حاصل می‌گردند، باززایی به سختی انجام می‌شود. پینه‌زایی و باززایی از مباحث اصلی پیشرفت و ترقی این علم محسوب می‌گردد که فایق آمدن بر پیچیدگی‌ها و موانع آن‌ها پشتوانه قدرتمندی را در عرصه‌های کشاورزی نوین فراهم خواهد کرد. به دلیل پایین بودن میزان پاسخ گیاهان به کشت بساک، دانشمندان تمام کوشش خود به بهبود محیط‌های غذایی کشت و بررسی زادمون‌های گیاهی و یک مرحله‌ای کردن کشت متمرکز ساخته‌اند. کشت بساک اولین بار در غلات و توسط نی‌ای‌زیکی (1967) در برنج انجام شد و تاکنون موفقیتهای چشمگیری حاصل گردیده است، اما پاسخ اندک به پینه‌زایی و باززایی و فراوانی گیاهان زال (Albino) از مشکلاتی هستند که محققان با آن‌ها روبرویند.





کشت رویان :

هنگامی که دامنه وسیعی از گونه‌های گیاهی برای کارهای عملی دورگ‌گیری مورد استفاده قرار می‌گرفت، کشت رویان به عنوان یک ابزار با ارزشی برای تولید گیاهان دورگ در تلاقی‌های دور رواج یافت. امروزه برای غلبه بر خواب بذر و عقیمی آن، نجات رویان تلاقی‌های دورگ‌های ناسازگار و باززایی گیاه در داخل لوله آزمایش از روش کشت رویان نارس استفاده می‌شود. در این حالت رویان از بذور نارس یا نزدیک به مرحله‌ی بلوغ جدا شده و در محیط غذایی مصنوعی کشت می‌شود. علاوه بر استفاده از این روش در تلاقی‌های بین گونه‌ای و بین جنسی که معمولاً در مرحله نارسی انجام می‌شود، از آن می‌توان برای تولید پینه‌های رویان‌زا از رویان نارس و رسیده به منظور تهیه پیش‌دش (پروتوپلاست) یا انتقال ژن و DNA که در زی فن شناسی مورد توجه فراوان قرار گرفته است، سودبرد. با به‌کارگیری روش نجات رویان دوره زادگیری (به نژادی) از چندین سال به چند ماه کاهش یافته است و تلاقی‌های بین گونه‌ای در تعدادی از گیاهان مهم اقتصادی مانند پنبه، جو، گوجه‌فرنگی و برنج به طور موفقیت آمیزی توسعه یافته است. کشت رویان نارس فقط در محیط‌های غذایی ویژه‌ای پاسخ می‌دهد و عواملی مانند افزایش فشار گذرندگی (اسموزی)، میزان پتاسیم زیاد، بالا بودن نیتروژن به شکل نمک آمونیوم اسیدهای آلی، اسید آبسزیک و کاهش فشار اکسیژن، جوانه‌زنی زودرس را به تعویق می‌اندازند. بنابراین علاوه بر رعایت اصول کلی تهیه محیط‌های غذایی کشت رویان بایستی به مواردی که در بالا اشاره شد نیز توجه نمود.









کشت پیش‌دش‌ :

پیش‌دش‌ها یاخته‌های عریانی هستند که دیواره‌ی یاخته‌ای آن‌ها به روش مکانیکی یا آنزیمی حذف شده باشد. موفقیت در تهیه پیش‌دش‌ها به مرحله‌ی تنکار شناختی منبع گیاهی، آنزیم‌های مورد استفاده و فشار گذرندگی (اسموزی) محیط غذایی کشت بستگی دارد. سوسپانسیون یاخته‌ای منبع اصلی کشت پیش‌دش است که از کشت پینه‌های حاصل از یاخته‌های جنسی و بدنی شامل ریزهاگ، تخمک، رویان نارس و رسیده، ریشه، برگ، ساقه، گره و سپرچه (کلئوپتیل)، غده و دمبرگ در محیط غذای مایع تهیه شده و سپس در محیط‌های غذایی محتوی آنزیم‌های سلولاز، پکتیناز، ماسروزیم، اسیدهای آمینه، بازهای اسیدنوکلئیک، هورمون‌ها، اسیدهای آلی، قند، قند الکل‌ها، آب نارگیل دیواره‌ی یاخته‌ای حذف می‌گردند و یاخته‌های مدوّرفاقد دیواره به دست می‌آیند. بازدهی و زیستایی پیش‌دش‌ها یعنی توانایی تولید مجدد دیواره‌ی یاخته‌ای و آغاز تقسیم یاخته ، به عوامل گوناگونی نظیر روش تهیه پیش‌دش، شرایط تنکار شناختی منابع گیاهی (نمونه زیرکشت و شرایط رشد)، نوع و غلظت آنزیم‌ها، ترکیب محیط غذایی کشت، استحکام غشای یاخته‌ای (پلاسمالما) و غیره بستگی دارد. از بعضی اندام‌های گیاهی به ویژه برگ می‌توان مستقیماً پیش‌دش‌ها را تهیه کرد. این یاخته‌ها به علت از دست دادن خاصیت نیمه‌تراوایی خود بایستی در محیط غذایی ویژه‌ای که فاقد آنزیم‌ها و مواد تجزیه کننده سلولزی و پکتینی است، قرار گیرند و پس از چند روز دیواره‌ی سلولزی را باززایی نمایند و آنگاه در محیط‌های غذایی پینه‌زایی و باززایی کشت شده و گیاه کاملی را تولید نمایند. باززایی گیاهی از پیش‌دش‌ها وسیله‌ی پرارزشی را در اصلاح گیاهان زراعی فراهم‌کرده است.

دورگ‌گیری یاخته‌های بدنی به روش همجوشی پیش‌دش‌ها انجام می‌شود و کاربرد آن عبارت است از :

1- تولید گیاه از دورگ‌های بین گونه‌ای با ناسازگاری جنسی.

2- تولید دورگ‌های سیتوپلاسمی (سیبرید) و انتقال ژن کلروپلاست از یک والد و میتوکندری از والد دیگر و دسترسی به تغییر پذیری سیتوپلاسمی شامل نوترکیبی بین اندامک‌های یاخته‌ای به ویژه میتوکندری.

3- تولید خط‌های نرعقیم سیتوپلاسمی.

4- انتقال DNA، اندامک‌های یاخته‌ای نظیر کلروپلاست‌ها، کروموزوم‌های جدا شده، باکتری‌ها، پلاسمیدها و غیره به منظور ایجاد گوناگونی‌های زاد شناختی یاخته‌ها، تراریختی پیش‌دش‌ها با استفاده از همجوشی آن‌ها با پلاسمید T i جدا شده فعالیت جالب توجه دیگری برای انتقال ژن است.

از همجوشی پیش‌دش‌ها، دورگ‌های هسته‌ای و سیتوپلاسمی حاصل می‌گردد که باززایی آن‌ها در مراحل مختلف تقسیم یاخته و در حین پینه‌زایی و تشکیل گیاه می‌تواند رخ دهد. این دورگ‌های بدنی ژن‌های هسته هر دو والد و سیتوپلاسم هر دو یا فقط یک والد را دارند. بنابراین در گیاهان حاصل از دورگ‌های بدنی تفرق صفات وجود دارد و در نتیجه چنین گیاهانی دارای ژن‌های هسته‌ای هر دو والد و سیتوپلاسمی یک والد را می‌توانند همراه داشته باشند.



سوسپانسیون یاخته‌ای :

کشت‌های سوسپانسیون یاخته‌ای عموماً به منظور تهیه یاخته‌ها یا توده‌هایی از آن‌ به شکل یاخته‌های منفرد و جدا از هم، از کشت بافت‌هاو پینه‌ها در محیط‌های غذایی مایع و در حال به هم زدن روی تکان دهنده‌های مکانیکی در درجه حرارت ثابت و شرایط نوری تعیین شده انجام می‌شود. یاخته‌های پینه در محیط غذایی مایع به دلیل تماس نزدیک با مواد غذایی و هورمون‌ها دارای میزان رشد و تکثیر بیشتری نسبت به محیط نیمه جامدند و در زمان‌های تعیین شده (برای پینه‌های برنج هر 7-4 روز) بایستی واکشت شوند تا اولاً محیط غذایی تازه در دسترس یاخته‌ها قرار گیرد و دوماً یاخته‌های مرده خارج شوند و سوماً میزان یاخته‌های تولید شده نسبت به مقدار محیط غذایی تنظیم گردد. از سوسپانسیون‌های یاخته‌ای در تهیه پیش‌دش‌ها، باززایی گیاهی از طریق اندام زایی یا رویان زایی در ریزازدیادی ممکن است استفاده شود. برای بنا نهادن کشت‌های سوسپانسیون یاخته‌‌ای، پینه‌های تمایز نیافته‌ای که در محیط غذایی القای پینه نیمه جامد تهیه شده اند را به محیط غذایی مایع انتقال می‌دهند. کشت‌ها روی تکان دهنده‌های چرخشی با سرعت 120-90 دور بر دقیقه در مدت زمان‌های معینی در تاریکی یا روشنایی و شدت نور معینی قرار داده می‌شوند. توده‌های یاخته‌ای ریز یا یاخته‌های منفرد معلق در محیط غذایی مایع را به روش صاف کردن از محلول جدا کرده و همراه با کاغذ صافی روی محیط غذایی القای رویان کشت می‌دهند تا این که پینه‌های ثانویه توسعه یابند و گیاهان تشکیل شوند.



کشت مرسیتم :

فناوری کشت مریستم عبارت است از کشت مریستم‌ جوانه‌های انتهایی و محوری شاخه‌های گیاهان در محیط‌های غذایی محتوی سیتوکنین‌ زیاد و تولید گیاهان کامل، که برای بسیاری از گیاهان زراعی به ویژه آن‌هایی که به روش تکثیر رویشی ازدیاد می‌یابند مورد استفاده قرار می‌گیرد. این روش برای حذف ویروس به ویژه در سیب‌زمینی که بیش از 20 نوع ویروس در آن شناسایی شده است کاربرد دارد. مریستم توده‌ای از یاخته‌های در حال تقسیم فعال و تمایز نیافته به قطر 1/0 میلی‌متر و طول 25/0 میلی‌متر است که فاقد سازگان آوندی بوده و بنابراین جمعیت ویروسی در آن‌ها پایین است و اغلب این ویروس ها به گیاهان حاصل انتقال نمی‌یابند. گیاهچه‌هایی که در آزمایشگاه تهیه می‌شوند از لحاظ زادشناختی همانند والد خود هستند و برای تکثیر سریع ذخایر بذری سیب‌زمینی و عملیات شیمی درمانی و گرما درمانی که بازدهی حذف ویروسی را بهبود می بخشند به عنوان مواد اولیه محسوب می‌گردند. علاوه بر سیب‌زمینی بسیاری از گیاهانی که آلودگی به ویروس در آن‌ها مشاهده شده است مانند چغندر قند، توت فرنگی، سیب‌زمینی شیرین، گل کلم، موز و گیاهان دیگری که از طریق رویشی تکثیر می‌یابند، این روش برای حذف ویروس مناسب است. در حال حاضر فنون کشت مریستم در تکثیر انبوه، حذف عوامل بیماری‌زا و حفظ ذخایر توارثی مورد استفاده قرار گرفته است.



ریزازدیادی:

بسیاری از بوته ها، درختچه ها و درختان ناجورتخمند و در زاده های بذریشان تفرقه داشته یا بذر تولید نمی کنند و نیز ممکن است بذورحاصل از آن ها دارای دوره‌ی خواب طولانی باشد. بنابراین برای حفظ خلوص زادشناختی این گیاهان از روش تکثیر غیر جنسی یا رویشی مانند قلمه زنی، پیوند زنی، خوابانیدن شاخه و کشت بافت استفاده می شود. تولید مثل غیر جنسی به روش کشت بافت را ریزازدیادی یا تکثیر کلنی می گویند.در حال حاضر فن‌آوری ریزازدیادی به طور تجارتی باسود بسیار عالی برای تولید هرساله میلیون ها نهال در سراسر جهان مورد بهره برداری قرار می گیرد. ریزازدیادی به علت تولید نهال‌های یکنواخت در مدت زمان های نسبتاً کوتاه ودر فضای تقریباً اندک اهمیت اقتصادی فراوانی کسب کرده است. فنون کشت بافت برای ازدیاد گیاهان یکی از مهیج ترین و با اهمیت ترین فعالیت های این علم است که از طریق باززایی اتفاقی (میا نگره، لبه‌ی برگ، لپه، منطقه‌ی رشد طولی ریشه که به طور طبیعی مریستم تشکیل نمی شود) و نوپدید (پینه ها و یاخته‌ها) تحقق می یابد. این روش در حال حاضر برای بسیاری از گیاهان زینتی و گلدار مانند ارکیده، رز، سبزیجات، سیب زمینی و درختان میوه مانند اوکالیپتوس در حال بهره برداری است. در سال 1993 حدود 501 آزمایشگاه کشت بافت گیاهی در سراسر جهان وجود داشته است. در اروپا بیش از 172 شرکت ریز ازدیادی و 1800 خط تولید کشت بافت مختلف در حال فعالیت بوده است(ریو رادیان،1994). مطابق برآورد سال 1990 ، بیش از 300 میلیون نهالی که هر سال از طریق کشت بافت در جهان تولید می‌شود، متعلق به کشور های نیوزیلند، انگلستان، ایالات متحده آمریکا و سایر کشورهای اروپایی بود(اگراول، 1996). بنا به گزارش استفان (1993) در سال 1991 بیش از 600 میلیون نهال با