به نام خدا


مقاله ارسالی یکی از دوستان


انتخاب درون شيشه اي كلون هاي توت فرنگي

( Fragaria * ananassa Duch. ) تحمل كننده ي تنش شوري







زمستان 87





















لغات كليدي:Fragaria * ananassa ،انتخاب درون شيشه اي،تحمل شوري،اصلاح توت فرنگي.



خلاصه:

روش انتخاب درون شيشه اي براي افزايش تحمل شوري در جوانه زدن بذر و مرحله ي اوليه ي رشد دان نهال هاي توت فرنگي پيشنهاد داده شده است. كلون pau/27در محيط كشت حاويmM 200 NaCl از جمعت به دست آمده از گرده افشاني آزاد رقم " Paula " انتخاب شده اند. سپس در محيط كشتي مشابه، 18 كلون تحمل كننده ي شوري از جمعيت بذر هاي جمع آوري شده از خود گرده افشاني گياهان pau/27 به دست آورده اند. در مرحله ي بعد اثر تنش كمي نمك را بر پارامتر هاي رشد رويشي كلون هاي انتخاب شده و رقم هاي " Paula" و "Senga Sengana" ،آزمايش كرديم. تمام مواد در اين آزمايش بر اساس شاخص هاي محاسبه شده ، به 4 گروه متفاوت در پاسخ به نمك تقسيم شدند. گروه اول (دسته رقم "Paula" ،Pau/27 و سه كلون نسل دوم :Pau/27/11، Pau/27/24، Pau/27/30) بيانگر ژنوتيپ هاي حساس هستند. گروه دوم شامل: Senga Senga ، Pau/27/06، Pau/27/10، Pau/27/13، Pau/27/15، Pau/27/18، Pau/27/20، Pau/27/21، Pau/27/26، Pau/27/27، Pau/27/31، Pau/27/32 را به عنوان متحمل ها برگزيده اند. گروه سوم تنها حاوي يك كلون شديدا" مقاوم Pau/27/08 است. گروه آخر دو كلون شديدا" حساس را شامل مي شوند(Pau/27/01، Pau/27/03).



مقدمه:

توت فرنگي ( Fragaria * ananassa Duch ) يكي از گونه هاي گياهي با تحمل پايين نسبت به شوري خاك است. نمك رشد رويشي گياهان و عملكرد ميوه را كاهش مي دهند. بهبود تحمل شوري در مواد جديدا" به دست آورده از اصلاح نباتات، مي تواند محصول دهي و سودمندي اقتصادي اين گياه را بهتر كند.

تحمل تنش شوري ، پديده اي پيچيده است. اين نژاد صفتي پلي ژني دارد. بسياري گزارشات، اطلاعاتي درباره ي مكانيزم هاي معمول مقاومت به انواع مختلفي از تنش هاي غير زيستي خصوصا" خشكي و شوري و همچنين شوري و سرما، مي دهند.

در اين مطالعه روش جديد و مفيد انتخاب درون شيشه اي توت فرنگي را آورده ايم با اين هدف كه تحمل نسبت به شوري را بهبود بخشيم.همچنين استفاده از معيار هايي را پيشنهاد داده ايم كه مقايسات مقاومت به خشكي بين كلون ها و واريته ها آسان تر مي كند.

مواد و روش ها:

روش انتخاب درون شيشه اي به صورت زير است:

1. بذر ها در هيپو كلريد سديم، استريليزه شده، 3 بار در آب مقطر استريل شسته شده، در محيط كشت PTO در پتري ديش قرار گرفته (قطر cm8) و به مدت 8 هفته در تاريكي و c5 بهارده شدند. محيط كشت PTO حاوي عناصر پر مصرف و كم مصرف با توجه به Murashing و Skoog، mg.dm100، gr.dm20 ساكارز و gr.dm6 آگار است. محيط كشت توسط اتو كلاو به مدت 20 دقيقه، در دماي c121 استرليزه شد. pH تا مقدار 02/0 +6/5 با N1/0 HCl يا N1/0 NaoH قبل از اتوكلاو، تنظيم شد.

2. بذر ها را به محيط كشت انتخابي (آماده شده به روش PTO گفته شده در بالا) مكمل با mM 200 NaClانتقال يافتند و در دماي ثابتc22 و دوره ي نوري 8/16 ساعت شب/روز نگه داري شدند.

3. گياهان جوانه زده و زنده بعد از 10 هفته در محيط كشت انتخابي را تحمل كننده شوري فرض كرده و درون شيشه تكثير مي يابند تا تبديل به كلون شوند.

گياهچه هاي رقم هاي "Paula " و "Senga Sengana" و "كلون Pau/27 " به عنوان متحملان شوري از بذر هاي "Paula" بعد از گرده افشاني باز، انتخاب شدند و 18 كلون انتخاب شده از نتاج خود گرده افشاني شده كلون Pau/27 ،تحليل شدند.(جدول 1 تا 5).

آزمايشات تعيين تحمل شوري در ظرف هايml500 حاوي حدودا" cm75 از محيط كشت انجام شدند. تاثير NaCl در غلظت mM75 در گياهان ، با توجه به رشد گياهان در محيط PTO فاقد نمك، تعيين شد. شرايط كشت مشابه دوره ي انتخاب بود. آزمايش در سه تكرار با 10 گياه به ازاي هر تكرار انجام شد.

قبل از شروع آزمايش، ريشه ها و برگ ها بريده شده و ساقه ها در شرايط استريل وزن شده و در محيط كشت داراي نمك و شاهد قرار گرفتند. بعد از 8 هفته رشد، پارامتر هاي زير براي هر دو شرايط كشت (NaCl mM 75، 0 mM ) اندازه گيري و محاسبه شدند.

1. افزايش وزن تازه ي شاخه (ISF75،ISF0) (وزن تازه ي شاخه شامل برگ هاي تازه تشكيل شده بعد از 8 هفته منهاي وزن تازه ي شاخه در نقطه ي شروع).

2. وزن تازه ي ريشه (RF0،RF75).

3. وزن خشك ريشه (RD0،RD75).

تفاوت هاي آماري بين ميانگين ها در آزمون توكي به دست آوردند. سپس ضرائب زير را كه توصيف كننده ي اثر نمك بر رشد هستند، محاسبه شد:

1. شاخص وزن تازه ي شاخه ISF=ISF0/ISF75؛

2. شاخص وزن تازه ي ريشه RF=RF0/RF75؛

3. شاخص وزن خشك ريشهRD=RD0/RD75؛

4. نسبت شاخص وزن خشك/ تازه شاخه

(وزن خشك شاخه/وزن تازه ي شاخه 0)/(وزن خشك شاخه/ وزن تازه ي شاخه 75)= SSDF

5. نسبت شاخص وزن خشك/ تازه ريشه

(وزن خشك ريشه/وزن تازه ي ريشه0)/(وزن خشك ريشه/ وزن تازه ي ريشه 75) SRDF=

5 ضريب آورده شده در بالا، به ما اجازه ي حذف وزن اوليه ي گياهچه را مي دهد. شاخص هاي ميانگين استاندارد شدند تا ضريب همبستگي پيرسون و ماتريكس هاي فاصلهEuclidean به دست آيد. تجزيه- هاي استاندارد و خوشه اي با استفاده از ماتريكس هاي نسبي با بسته ي NTSYSpc 2.10q انجام شدند.









نتايج:

انتخاب معيار ها براي مقايسات درون شيشه اي تحمل شوري، كاري بسيار مشكل است. اندازه گيري هاي وزني در محيط كشت حاوي نمك(ISF75) به عنوان تنها نماينده ي تحمل شوري مي تواند گمراه كننده باشد. بهترين ژنوتيپ ها :Pau/27/15 ،Pau/27/24، Pau/27/13 حداكثر افزايش وزن تازه ي شاخه را نه تنها در محيط كشت نمكي، همچنين شاهد، داشته است. كلون هاي Pau/27/31، Pau/27/03 از انتهاي ديگر طيف واكنش، افزايش كمي از وزن تازه شاخه، بدون در نظر گرفتن وجود يا نبود نمك نشان داده- اند(جدول 1). اين تفاوت هاي بيشتري را در پاسخ به شرايط كشت درون شيشه اي نسبت به تفاوت ها در تحمل شوري، بيان مي كند.

وقتي شاخص وزن تازه ي شاخه (ISF) تحليل شد، تفاوت هاي بين كلون ها در رشد در محيط كشت با يا بدون نمك، شفاف تر بود. ميزان ISF نزديك به 1 نشان دهنده ي تاثير نمك بر رشد گياهان است. مقادير كمتر از 1 تحريك رشد را نشان مي دهد. مقادير بيشتر از 1 به كاهش وزن در اثر تنش شوري اشاره دارد (جدول2).

تحريكي واضح در Pau/27/08(ISF=0.54)، Pau/27/15(0.64)،رقم "Senga Sengana"(0.67)، Pau/27/10(0.69) مشاهده شد. كلون Pau/27 به دست آمده بعد از چرخه ي انتخاب اوليه (ISF=1.12) بهتر از جد مادري اش رقم Paula عمل كرد(03/2). در نسل انتخابي دوم، 12 تا 18 كلون بهتر بوده و بعد از Pau/27، 4 تا بدتر و 2 تا مشابه بودند.

كلون هاي تجزيه شده در تحريك وزن تازه و خشك در ريشه ها متفاوت بودند(جدول 1). مشاهده كرديم كه به طور مشابه، در مورد شاخه هاي RF75و RD75 بيشتر پاسخ به شرايط درون شيشه اي به نسبت شوري را نشان مي دهند و بايد هميشه وقتي مقايسه انجام شود كه به RD0 و RF0 تماس داشته باشد. كلون Pau/27 استثناء جالبي از اين الگوي كلي است با تحريك بالاي وزن خشك در ريشه ها در هر دو محيط كشت حاوي و فاقد نمك، همچنين هيچ تاثير نمك بر پارامتر هاي RF وجود نداشته است.




شيوه ي ديگر عكس العمل در Senga Sengana مشاهده شد. شاخه هاي اين واريته (ISF=0.61) توسط نمك تحريك شد، در حالي كه پاسخ به شوري ممكن است مخصوص اندام باشد و الگوي پاسخ بين كلون ها متفاوت باشد.

براي بررسي تاثير نمك بر ميزان آب، نسبت وزن خشك به وزن تازه ي اندام ها تعيين شد. مقادير SSDF و SRDF نزديك به 1 ژنوتيپ هايي را توصيف مي كنند كه ميزان آب را در اندام هايشان در پاسخ به تنش شوري تغيير نمي دهند. كه اين ممكن است از توانايي بالاي سازگاري منشاء بگيرد. بر اساس مقايسات SSDF و SRDF (به ترتيب75/0 و 7/0 )، احتمال داده اند كه Paula حساس است. در مورد Senga Sengana مقادير مناسب 11/1 و 7/0 هستند. مقادير بالاي هر دو پارامتر در Pau/27/08 و Pau/27/10 و Pau/27/31 . اثر شاخص هاي محاسبه شده بر تغيير پذيري كل، در كلون ها و رقم هاي تجزيه شده، در جدول 3 خلاصه شده است.

تمام پارامتر ها شديدا" ميزان اولين تركيب اصلي را تحت تاثير قرار داده است (95/0-87/0)، كه تفاوتي 76%ي را شرح مي دهد، تماس اولين جزء بر پلي مورفي (چند ريختي)، ارتباطي قوي را بين شاخص هاي مورد استفاده، نشان مي دهد(جدول4). رابطه ي منفي بين توصيف هاي عادات رشد(ISF، RF، RD) و نسبت وزن خشك به تازه (SRDF، SSDF)،كشف شده است. اين دلالت بر اين دارد كه SSDF و SRDF به نسبت تحمل شوري افزايش پيدا مي كنند. واريته ها و كلون ها به 2 گروه تقسيم شده اند كه ژنوتيپ هايي را با خصوصيات مشابه تجزيه دسته ي شاخص هاي ISF، RF، RD، SSRD، SRDF ، را جمع كرده.

در نمودار شجره اي UPGMA، تمام كلون ها و ارقام اصلاحي به 4 گروه (دسته) تقسيم شده اند. دسته هاي 1 و 2 توسط مقادير متوسط 5 شاخص (جدول 2) توصيف شده اند. در كلون هاي گروه اول، Pau/27/11 ، Pau/27/30، Pau/27/24، همراه با اجدادشان Paula و Pau/27 قرار گرفتند. اين گروه حساس و با ISF، RF، RD بالا و SSDF و SRDF پاييني هستند. گروه دوم – متحمل- بزرگترين و شامل Senga Sengana بوده است. گروه سوم تنها از يك كلون شديدا" متحمل Pau/27/08 تشكيل شده. گروه چهارم حاوي دو ژنوتيپ حساس بوده است: Pau/27/01 و Pau/27/03 با مقادير بالاي ISF ، RF، RD و كم SSDF و SRDF.









نتيجه گيري:

توت فرنگي بسيار حساس به شوري خاك است. تنش شوري، عملكرد و رشد رويشي گياهان را كاهش مي دهد. تحمل شوري مي تواند توسط انتقال ژن هايي از گونه هاي وحشي توت فرنگي مانند:

Fragaria chiloensis بهبود يابد.در برنامه ي انتخابي ما، منابع ژنتيكي موجود در جمعي مزرعه اي از

رقم ها و كلون هاي اصلاح شده حاوي بيش از 80 نمونه، استفاده شدند. اولين نسل گياهان توسط

گرده افشاني آزاد Paula به دست آورد. اين اجازه مي دهد تا ژن هاي متحمل در گروهي باريك از

افراد انتخابي، جمع شود. از اين افراد، يك كلون به نام Pau/27 براي مطالعات بيشتر انتخاب شد.

18 كلون از نسل دوم بعد از انتخاب در نتاج Pau/27 خود گرده افشاني شده، به دست آمد. اين

كلون هابعد از تكامل و تمايز به 4 گروه با پاسخ هاي متفاوت به شوري تقسيم شدند(شكل 1). بعضي




از آنها، بسيار حساس بودند و بر اين اشاره دارد كه شرايط انتخاب (دوره ي آزمايش و يا غلظت نمك)

به حد كافي دقيق نبوده است. اين اجازه مي دهد تا توسط گياهاني از غربال انتخاب عبور داده شود.


اين گياهان تنها در مرحله ي جوانه زني مقاوم به شوري هستند اما در مرحله ي بعدي رشد و نمو، تحمل نشان نمي دهد. اين فرض با كشفيات Hughes & Wright (1993) سازگار است. آنها مشاهده كردند كه هيبريد هاي بين F. ananassa و F. chiloensis حساسيت كمتري نسبت به شوري در جوانه زني درون شيشه اي، در مقايسه با گياهان بالغ آزمايش در هيدروپونيك بوده است.Chartzoulakis & Klapaki (2000) نيز در كشت هيدروپونيك با اين روبرو شدند كه رشد رويشي دان نهال هاي فلفل توسط شوري بيشتر از جوانه زني بذر تحت تاثير قرار گرفته است. جوانه زني بذر توسط غلظت هاي NaCl بيشتر از

mM 150 ، محدود شده است. اين نتيجه مي تواند توسط وجود حداقل دو مكانيزم تحمل شوري، توضيح داده شود.اولا"، فعال در دوره ي جوانه زني. ثانيا"، تعويض با مراحل ديگر رشد. چنين وضعيتي توسط Foolad (1999) در گوجه فرنگي گزارش داده شد. تمام اين مشاهدات دلالت بر اين دارد كه فشار انتخابي بايد براي دوره اي طولاني تر بعد از جوانه زني اعمال شود.

در بررسي ما، تفاوت هاي قابل توجهي در پاسخ به شوري بين اندام هاي ژنوتيپ مشابه، مشاهده شد. اين ممكن است در نتيجه ي بيان ژن هاي خاص بافتي باشد كه مقاومت به شوري گزارش شده در ديگر گونه ها را نشان داده است. هيچ توافقي وجود ندارد كه رشد چه قسمت گياه توسط نمك بيشتر محدود مي شود. Khan et al (98/1997) مشاهده كرد كه توده ي بيوماس در شاخه هاي يونجه به حد كمتري از ريشه ها، كاهش يافته است. الگوي مشابه ي از پاسخ توسط Lopez & Satti(1996) در گوجه فرنگي مشاهده شد.

در توت فرنگي يافتيم كه تفاوت هاي در حساسيت به شوري بين ريشه ها و شاخه ها (بر اساس ISF و RF)، خاص ژنوتيپ بودند. در 7 كلون از 21 ريشه آزمايش شده، حساس تر بوده اند. در 12 تا ريشه ها شديدا" تحت تاثير قرار گرفتند. در دو كلون ديگر، هيچ تفاوت قابل مشاهده اي بين ريشه ها و شاخه ها وجود نداشت. با وجود اشاره شده در بالا، بي نظمي هاي بالاي رابطه بين RD,RF, ISF كاهش اين مقادير را در برنامه هاي اصلاحي مقياس بزرگ، تنها در ريشه ها توصيه مي شود.

كاربرد عملي SSDF , SRDF نياز به بررسي هاي بيشتري خواهد داشت. آزمايشات بايد روي موادگياهي متفاوت در تحمل شوري انجام شوند و همچنين طيف وسيعي از غلظت هاي نمك بايد آزمايش شود. داده هاي قبلا" جمع آوري شده نشان مي دهد كه ژنوتيپ هاي انتخاب شده به عنوان مقاوم به نمك از نتايج Pau/27 ،در بعضي موارد به نسبت والدينشان در شرايط درون شيشه اي بهتر عمل كرده و رشد بيشتري داشته است، در حالي كه بعضي كلون هاي اين نسل شديدا"، تحت تاثير قرار گرفتند. اين مي تواند اثري از ركود خويش آميزي آشكار شده پس رويشي باشد. مهمترين مزيت روش ما، امكان كنترل كامل روي ميزان تنش اعمال شده به گياه است اما معايبي نيز در اثر شرايط كشت و روش هاي آزمايش نيز دارد كه مي تواند مورد توجه قرار گيرد.

انتخاب درون شيشه ي توت فرنگي در محيط كشت حاوي نمك در دوره ي جوانه زني و رشد اوليه ي دان نهال، انجام شد تا كلون هايي با تحمل شوري بالا تري حاصل شوند. اين ارزش عملي بررسي را نشان مي دهد. اين روش نسبتا" ساده و ارزان است. ممكن است به وسيله اي مهم در اصلاح تحمل شوري توت فرنگي تبديل شود.

[img=http://www.tinypic.info/files/fw0hek0jz4ewwkbbzudb_thumb.jpg]